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A inferência do sistema de acasalamento em peixes Neotropicais, que habitam rios caudalosos e possuem fertilização externa, é um grande desafio. A agregação de peixes formando cardumes reprodutivos já foi observada para Prochilodus lineatus, contudo, informações sobre o sistema de acasalamento da espécie em ambiente natural são escassas. Os objetivos deste trabalho foram investigar as relações de parentesco entre 87 larvas de P. lineatus coletadas em ambiente natural no Médio rio Uruguai, Sul do Brasil, e inferir o número de parentais envolvidos na reprodução. Utilizamos 11 locos microssatélites altamente variáveis (77 alelos, 4-33 alelos/loco, heterozigosidade esperada = 0,70 e observada = 0,63). As análises de parentesco por máxima-verossimilhança atribuíram dois pares de larvas como irmãs completas e 207 pares como meio- irmãs. A reconstrução parental baseada em marcadores moleculares identificou 40 machos e 35 fêmeas como possíveis parentais; ao menos quatro fêmeas apresentaram seus ovócitos fertilizados por quatro machos, e ao menos um macho fertilizou ovócitos de até quatro fêmeas distintas. Esses resultados, em conjunto, sugerem a ocorrência de poligiandria, sistema de acasalamento em que machos e fêmeas têm múltiplos parceiros de acasalamento, em P. Lineatus, com a participação efetiva de ao menos 75 parentais. Assumindo acasalamento ao acaso, o tamanho populacional efetivo foi de 105 indivíduos. Este estudo amplia o conhecimento sobre a genética comportamental, inferetáticas reprodutivas da espécie que não podem ser observadas a campo e contribui novas informações que podem ser relevantes no contexto da biologia da conservação de peixes migratórios Neotropicais.