IBS   24490
INSTITUTO DE BIOLOGIA SUBTROPICAL
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Puesta a punto de una técnica nested-PCR diferencial para el virus de la leucosis bovina.
Autor/es:
ALVAREZ, I; FABDALA,; PETERSEN, CMI;; RUIZ, V; SUAREZ ARCHILLA, GA; JAWORSKI, JP; ; CALVINHO, L; KARINA TRONO
Lugar:
BUEOS AIRES
Reunión:
Jornada; XXVII Reunión anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016
Institución organizadora:
ASOCICION ARENTINA DE VIROLOGIA
Resumen:
El virus de la leucosis bovina (VLB) tiene unaalta prevalencia en Argentina. Por este motivo, las estrategias clásicas de control (segregación y sacrificio)no pueden ser instauradas. Considerando que no existe una vacuna efectiva,las estrategiasdestinadas a erradicar la enfermedad en nuestro medio deberían estar enfocadas ensistemas no tradicionales. Una opción es el uso deuna cepa viral atenuadacapaz de estimular la respuesta inmune pero con capacidad replicativa disminuida, que le permita al hospedador resistir frente al desafío natural presente en el campo. En este contexto, es imprescindible contar con una técnica para diferenciar animales infectados con la cepa vacunal atenuada y la cepa de campo. El objetivo del presente trabajo es realizar la puesta a punto y validación de una técnicaPCR con este fin. Con este propósito, se analizaron 36 muestras de sangre bovina que provenían de animales con serología positiva a VLB. Una proporción de éstas, pertenecían a bovinos inoculados con la cepa modificada.A partir del buffycoat se extrajo ADN utilizando un kit comercial y una técnica porsalting-out con Acetato de Potasio. Estas muestras de ADN se analizaron por una técnica de nested-PCR diferencial que permite amplificar una porción de la región regulatoria X de VLB. Los cebadores utilizados durante la segunda vuelta de PCR, flanquean el fragmento delecionado (383 pb) en la cepa atenuada.La visualización de los productos de PCR, permite diferenciar amplicones correspondientes a la cepa de campo (610 pb) o modificada (230 pb). A partir de este estudio, observamos que la técnica de nested-PCR fue capaz de diferenciar animales inoculados con la cepa atenuada de aquellos infectados naturalmente. Asimismo, la técnica de nested-PCR demostró un buen grado de repetibilidad y reproducibilidad. Ambas técnicas mostraron un alto nivel de sensibilidad analítica. Del total de 36 muestras analizadas por nested-PCR, 28 fueron positivas y 8 negativas. De las muestras positivas, 22 correspondieron a la cepa de campo y 6 a la cepa atenuada. Las 36 muestras se analizaron por qPCR obteniendo una misma proporción de muestras positivas (28/36) y negativas (8/36). Sin embargo, 3 de las 6 muestras positivas a la cepa atenuada (nested-PCR) fueron negativas por esta técnica. Por otra parte, se observaron resultados positivos -de muy baja carga- porqPCRque no fueron detectados por nested-PCR (n=3).Estos resultados demostraron que la técnica denested-PCR fue capaz de diferenciar animales infectados con la cepa de campo y la cepa atenuada. Asimismo, la nested-PCR mostróuna buena repetibilidad y una sensibilidad analíticacomparable a la qPCR.A partir de estos resultados, se realizará una validación extensiva del ensayo con el propósito de ser utilizado como una herramienta diagnostica y diferencial.