Desarrollo de complejos enzimáticos celulolíticos y hemicelulolíticos microbianos para la valorización de residuos agroindustriales

COUTO, ALICIA; LANDONI, MALENA; WIRTH, SONIA; GARRIDO, MERCEDES; CAMPOS, ELEONORA

Buenos Aires

Jornada; Jornadas Exactas y el agro: aportes a la actividad agropecuaria y agroindustrial; 2019

Faculta de Ciencias Exactas y Naturales, UBA

La lignocelulosa es una estructura compleja presente en la pared celular vegetal compuesta principalmente por microfibrillas de celulosa, homopolímero de glucosas con enlaces β-1,4, rodeadas de hemicelulosa, heteropolímero de pentosas y hexosas con diversas ramificaciones, que a su vez se encuentran comprendidas dentro de una matriz de polifenoles aromáticos que componen la lignina. Existen en la naturaleza diversos microorganismos capaces de hidrolizar esta estructura recalcitrante a través de la síntesis de enzimas lignocelulolíticas. Estas enzimas, conocidas como Enzimas Activas sobre Carbohidratos (CAZYmes) se agrupan en diferentes familias, incluyendo glicosilhidrolasas (GHs) y actividades auxiliares (AAs). El presente trabajo tiene como objetivo el desarrollo de complejos enzimáticos celulolíticos y hemicelulolíticos bacterianos y fúngicos para su utilización en el aprovechamiento los residuos agroforestoindustriales. Para comenzar con el objetivo propuesto, se seleccionó la secuencia de una monooxigenasa lítica de polisacáridos (LPMO) perteneciente a la familia AA9, proveniente del hongo basidiomicete Pycnoporus sanguineus, con presunta actividad sobre celulosa. El gen sintético correspondiente (900 pares de bases) fue clonado con su péptido señal nativo N-terminal en fusión con un tracto de 6 histidinas C-terminal en el vector pPIC9, vector de expresión de proteínas recombinantes en Pichia pastoris inducible por metanol. En esta familia de enzimas, la Histidina N-terminal de la proteína madura es clave para la actividad enzimática. La proteína recombinante (60 kDa) fue detectada en el sobrenadante del cultivo inducido y purificada por afinidad a resina de Niquel, después de pasos de concentración y cambio de buffer. La identidad y el correcto procesamiento de la proteína recombinante secretada fueron corroborados por proteómica (CEQUIBIEM, UBA). Al ensayar la actividad enzimática sobre PASC (celulosa pretratada con ácido fosfórico), se detectaron oligosacáridos cortos oxidados y no oxidados (DP2 a DP5) por espectrometría de masas (MALDI-TOF) y cromatografía de intercambio aniónico (HPAEC-PAD), confirmando su actividad sobre celulosa.