CLONADO Y EXPRESIÓN EN PICHIA PASTORIS DE LA LACASA LGS1 DE GRAMMOTHELE SUBARGENTEA LPSC 436.

MAJUL LEONARDO; SAPARRAT, MARIO; WIRTH, SONIA

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Micología; 2014

Asociación Argentina de Micología

BMA15 CLONADO Y EXPRESIÓN EN PICHIA PASTORIS DE LA LACASA LGS1 DE GRAMMOTHELE SUBARGENTEA LPSC 436. Majul L1, 2; Saparrat M3; Wirth S1 1Laboratorio de Agrobiotecnología, FCEN-UBA. IBBEA-CONICET 2Laboratorio de Micología Experimental, FCEN-UBA. 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Instituto de Botánica Spegazzini, UNLP. INFIVE CCT-La Plata CONICET. Las lacasas (EC 1.10.3.2 bencenodiol: oxígeno oxidorreductasas) son fenol oxidasas de la superfamilia de las oxidasas multicobre, que en conjunto con las peroxidasas y otras enzimas accesorias forman parte de la batería de enzimas modificadoras de lignina de los hongos ligninolíticos. Además de su rol en la mineralización de la lignina, las lacasas son capaces de degradar diversos compuestos fenólicos recalcitrantes, constituyéndose en candidatas para su aplicación en procesos de biorremediación. Grammothele subargentea LPSC 436 es un basidiomicete de la pudrición blanca que en condiciones de inducción con Cu2+ expresa altos niveles de actividad lacasa, siendo capaz de degradar la lignina y compuestos lipofílicos de la madera de Eucalyptus globulus, así como una amplia variedad de colorantes sintéticos. Sin embargo, la enzima responsable de esta actividad no ha sido clonada hasta la fecha. En este trabajo utilizamos oligonucleótidos degenerados correspondientes a las regiones conservadas de unión a cobre en las lacasas fúngicas y las técnicas de 5´RACE y 3´RACE PCR, para amplificar y ensamblar la secuencia codificante completa de la lacasa Lgs1 de G. subargentea. La secuencia clonada codifica una proteína con una longitud de 521 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 21 aminoácidos y las cuatro regiones de unión a cobre L1 a L4 características de las lacasas, así como 10 motivos Asn-Xaa-Ser/Thr de potencial N-glicosilación. El análisis comparativo con otras lacasas fúngicas mostró que la Lgs1 comparte un 90% de identidad con una lacasa descripta en Lentinus sp WR2 (GenBank ACZ82339) y entre el 79 y 81% de identidad con lacasas de Dichomitus squalens, Ganoderma lucidum y miembros del género Trametes (T. sanguinea, T. coccineus, T. cinnabarina, T. gibbosa, T. versicolor y T. hirsuta). Adicionalmente, el gen codificante de la lacasa Lgs1 fue expresado en la levadura metilotrófica Pichia pastoris para realizar su caracterización cinética y bioquímica.