Detección de la enzima nNOS en arterias de By Pass coronario-Resultados preliminares

FERNANDEZ, D; DELGADO, M. A.;; GUARDIA, C; VINCENT, P.;; JOO TURONI, C; PERAL, M

San Miguel de Tucumán- Tucumán

Congreso; IX Reunión de Investigación en Ciencias de la Salud; 2007

Dpto de Investigación Facultad de Medicina-UNT

DETECCIÓN DE LA ENZIMA nNOS EN ARTERIAS DE BY PASS CORONARIO-RESULTADOS PRELIMINARES Fernández, D; Delgado, M A; Guardia, DC; Vincent, P; Joo Turoni, C; y Peral, M (Directora). Dpto. de Bioquímica de la Nutrición. INSIBIO-CONICET; Chacabuco 461. Tucumán CP: 4000- TE: 4248921 mariaperal@arnet.com.ar. Resumen: el oxido nítrico (NO) es un importante regulador del tono vascular. En nuestro laboratorio (Joo Turoni y cols 2007,  PMID: 17653967 PubMed) encontramos que las arterias de by-pass coronario producían liberación NO por activación de una NO sintetasa neuronal (nNOS). Objetivos: Determinar por la técnica de inmunoelectrotransferencia (Western Blot) la presencia de nNOS en arteria de rata como paso previo para la detección de la enzima en vasos humanos. Metodología: Se extrajeron aortas de ratas Sprague-Dawley (250-300g) colocándolas en solución de Hank a 37°C por 40 min. con colagenaza para remover la capa adventicia. Las arterias fueron congeladas con nitrógeno liquido y mantenidas a -70°C hasta los ensayos. Se recolectaron 40 arterias (peso=168mg)  y se homogeneizaron en buffer HEPES-Sucrosa a pH 7.4 con inhibidores de proteasas. El homogenato se centrifugó 15 min. a 12.000 r.p.m y el contenido de proteínas en el sobrenadante  se determinó por el método de Bradford (4,23ug/ml). Se separaron y desnaturalizaron igual cantidad de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes SDS-PAGE 7,5%. Se corrieron conjuntamente proteína purificada de rata (nNOS rabbit: SIGMA) y un homogenato de cerebelo de rata o cerebelo de conejo como control de la enzima, procesados de igual forma. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa por una hora, bloqueándose con buffer TBS-Tween con 5% de leche descremada. Se incubó con el anticuerpo anti nNOS dil1/2000  por una hora, se lavó con buffer TBS y se incubó con Ac Anti-conejo conjugado con peroxidasa dil1/5000 y con el cromógeno TMB. Resultados: se detectó una banda marcada en el control de peso molecular de 160 kd que identifica a la enzima pura, observándose bandas proteicas en cerebelo pero no en arterias. La transferencia a nitrocelulosa (Western Blot) dio una banda de igual posición para nNOS. Discusión: Si bien se puso a punto la técnica para la detección de proteína pura nNOS, necesitamos partir de mayor cantidad de proteína total para lograr detectar la enzima que se expresaría en muy baja cantidad.