Obtención de vectores adenovirales para su uso en terapia génica antitumoral,

MARIANELA CANDOLFI; ANTONELA ASAD; FLAVIA ZANETTI; CAMILA ZUCCATO; MARIELA MORENO AYALA; ADRIANA SEILICOVICH; ALEJANDO JAVIER NICOLA CANDIA

Congreso; Congreso Argentino de Virología; 2017

Los vectores virales basados en adenovirus recombinantes (Adr) se emplean desde hace más de tres décadas para la obtención de vacunas de nueva generación con aplicación en salud humana y sanidad animal, para transducir células y como vehículos en terapia génica. Los Adr se obtienen mediante técnicas sencillas y con altos títulos, los viriones presentan buena estabilidad física y genética, infectan células en división y quiescentes y el material genético permanece en forma episomal con altos niveles de expresión del transgen. Con el objetivo de mejorar la eficacia de las vacunas antitumorales de células dendríticas (CDs), hemos utilizado un péptido de penetración celular (P60) inhibidor de Foxp3, un factor de transcripción requerido para la función de células T reguladoras (Treg). Nuestros resultados previos indican que la administración sistémica de P60 aumenta la eficacia de vacunas de CDs en modelos murinos de cáncer de mama. Dado que los péptidos administrados en forma sistémica tienen muy corta vida media, el objetivo del presente trabajo fue obtener un Adr que exprese P60 (denominado Ad.P60) bajo el control del promotor CMV y su correspondiente Adr control (Ad.dTomato). Para ello las secuencias nucleotídicas heterólogas (fragmento de 1655 pb que contiene al gen p60, una secuencia IRES, el gen reportero dtomato -cuyo producto es una proteína roja fluorescente- y la secuencia polyA de SV40 y el fragmento de 1030 pb que incluye el gen dtomato seguido de la secuencia polyA de SV40) se amplificaron por reacción de PCR utilizando oligonucleótidos iniciadores específicos y como templados los plásmidos (terapéutico y control) disponibles en el laboratorio. Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEMT-Easy (Promega) y luego se subclonaron en el vector de entrada pENTR4 (Invitrogen). Posteriormente se realizaron las reacciones de recombinación entre los vectores de entrada (pENTR4-P60 y pENTR4-dTomato) y el vector de destino pAd-CMV/V5-DEST (Invitrogen). Los plásmidos obtenidos pAd-CMV-P60 y pAd-CMV-dTomato contienen, además de las secuencias de interés, todo el genoma de adenovirus excepto la región codificante para las proteínas E1 y E3. Los plásmidos pAd-CMV-P60 y pAd-CMV-dTomato se digirieron con la enzima de restricción PacI, para exponer las regiones ITRs, y se transfectaron en células HEK293A que expresan constitutivamente los productos de los genes virales E1 y E2 permitiendo la formación de las partículas virales infectivas. Los stocks virales se cosecharon luego de la aparición de efecto citopático (7-14 días post transfección). La inserción de las secuencias foráneas y la expresión del gen reportero en ambos Adr se constató por reacciones de PCR con oligonucleótidos específicos y por observación microscópica de fluorescencia roja emitida en células infectadas y expuestas a luz ultravioleta, respectivamente.Finalmente, la eficacia del vector adenoviral Ad.P60 será evaluada en modelos murinos de cáncer de mama.