Evaluación de la actividad proteolítica de micropartículas esféricas de papaína sobre colágeno

VENTURA, F.; BARSANTI, A.; D'ERAMO, L.; CHIARAMONI, N.; MENDEZ, C.F.; ALONSO, S.; SANTOS, J.; SQUASSI, A.

Rosario

Congreso; XLVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Odontológica; 2014

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Objetivo: desarrollar micro partículas esféricas de papaína con tamaño definido con capacidad de liberación controlada y evaluar su actividad proteolítica sobre colágeno. Métodos: a efectos de sintetizar nanopartículas de papaína entrecruzada, las muestras de proteasa (15, 30 o 40 mg/ml) se disolvieron en buffer fosfato de sodio pH 7.0 en presencia del agente precipitante etanol (15, 20 y 30%) y se irradairon con radiación gamma (10 kGy). Las dimensiones de las nanopartículas se verificaron por dispersión luminosa dinámica. Con el objeto de eliminar la proteasa soluble monomérica remante a la irradiación, las muestras conteniendo partículas fueron centrifugadas (1500 rpm, 15 min a 20°C). Posteriormente, el pellet fue lavado con buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7.0. La actividad proteolítica se estudió mediante un ensayo de degradación de gelatina a 25°C en buffer fosfato de sodio 50 mM, EDTA 1 mM, cisteína 0,1 mM y gelatina 2%. La degradación del colágeno, producto de la actividad proteolítica de la papaína, resulta en la no gelificación de la gelatina degradada y en la liberación de aminoácidos que la componen, entre ellos la tirosina (Tyr). El material insoluble y los restos de gelatina no degradada son separados por precipitación con ácido tricloaroacético 15% y posterior cntrifugación (1500 rpm, 15 min a 20°C). El colágeno no contiene triptofano y el coeficiente de extinción del residuo de fenilalanina a 280 nm es despreciable. El único residuo de esta proteína que aporta a la absorción UV a 280 nm es la Tyr, que es fácilmente cuantificable a partir de espectros de absorción entre 340-260 nm en los sobrenadantes de las muestras después de realizar correcciones, teniendo en cuenta los blancos correspondientes y efectos de la dispersión luminosa. Resultados: las muestras de partículas de papaína 30 mg/ml, etanol 30% poseen un 10% de la actividad presente en muestras irradiadas de la misma forma en ausencia de etanol (papaína monomérica soluble). Conclusión: los resultados de dispersión luminosa y el comportamiento coloidal conformado por la presencia de dos fases, una continua y otra dispersa, indican que la proteasa en presencia de etanol como precipitante se modifica covalentemente y forma un material particulado enzimáticamente activo.