CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE LA TIROPEROXIDASA HUMANA. EXPRESIÓN NORMAL Y PATOLÓGICA DE LA ENZIMA EN EL SISTEMA DE BACULOVIRUS: UN MODELO MOLECULAR DE EXPRESIÓN FUNCIONAL

FIORELLA BELFORTE; ALEXANDRA M. TARGOVNIK; RODOLFO GONZALEZ LEBRERO; MARÍA CECILIA OLSESE; CAROLINA OSORIO LARROCHE; MARÍA VICTORIA MIRANDA; ROGELIO GONZALEZ SARMIENTO; HÉCTOR M. TARGOVNIK; CARINA M. RIVOLTA

Mar del Plata

Congreso; LIX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2014

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

La Tiroperoxidasa humana (hTPO) es una glicoproteína de membrana apical de células foliculares tiroideas responsable de catalizar la oxidación de yoduro y su organificación en los residuos de tirosina de la Tiroglobulina (Tg), propiciando la síntesis de hormonas tiroideas por acoplamiento de los residuos yodados. Las mutaciones en el gen hTPO son la causa principal de defectos hereditarios de organificación de yodo (IOD). El objetivo del estudio fue investigar el impacto funcional de mutaciones con cambio de sentido en el gen de hTPO previamente identificadas en nuestro laboratorio (p.C808R, p.G387R y p.P499L). Se procedió al clonado secuencial del mensajero de hTPO en el vector pGEMT a partir de muestras de tejido tiroideo humano, con el fin de obtener la secuencia codificante completa de tipo salvaje (WT) de hTPO. Se efectuó mutagénesis dirigida empleando el kit QuickChangeII Site Directed Mutagenesis siendo las secuencias codificantes tanto WT como mutantes clonadas en el vector de transferencia pAcGP67B y las proteínas recombinantes expresadas en el Sistema de Baculovirus utilizando la línea celular SF9. Se recurrió al fraccionamiento subcelular de cultivos infectados y a su caracterización por SDS-PAGE y Western blot. Las fracciones enriquecidas con proteínas recombinantes fueron evaluadas bioquímicamente determinando parámetros cinéticos de la versión WT y mutantes de hTPO mediante el algoritmo Gauss-Newton. Se evidenció una disminución de la actividad enzimática en los tres mutantes, con menor afinidad por el sustrato (KM mayores) así como eficiencias de reacción inferiores (Vmax/KM) con respecto a hTPO WT. En conclusión, resultaron posibles el clonado y puesta a punto de la expresión, purificación y caracterización funcional de hTPO recombinante empleando el Sistema de Baculovirus obteniéndose por primera vez las constantes cinéticas asociadas a la hTPO y variantes portadoras de mutaciones responsables de IOD.