El control de la expresión/localización de nNOS como reloj mitocondrial del envejecimiento a través de la modulación de la actividad de SirT3

PÉREZ H, ALIPPE Y, ELGUERO ME, CONVERSO DP, CARRERAS MC, PODEROSO JJ

Buenos Aires

Congreso; 14° Congreso Internacional de Medicina Interna del Hospital de Clínicas; 2012

Hospital de Clínicas

Objetivos: A) si los cambios progresivos involucrados en el envejecimiento son los responsables del incremento de mtROS; B) si los efectos inducen estrés oxidativo y nitrativo, y C) si la nitración y el desequilibrio de la relación NAD/NADH afectan la actividad de SirT3. Materiales y Metodos: Grupos etarios de ratas de entre 3 a 24 meses fueron utilizados para el fraccionamiento subcelular de hígados y cerebros. La actividad de NOS fue medida a través de la conversión de L-arginina a L-citrulina. Se midió la producción de H2O2 mitocondrial dependiente de mtNOS. Se analizó la expresión de nNOS mediante WB y se determinó el nivel de mRNA de nNOS a través de RT-PCR. La actividad de Mn-SOD y del complejo I se realizó mediante espectrofotometría. Se analizó la actividad de SirT3 y la relación NAD/NADH en mitocondrias mediante KITs comerciales. El análisis estadístico fue realizado mediante one-way analysis of variance (ANOVA) y se utilizo el test postoc Dunnett´s Resultados: Se confirmó que en cada edad hay un contenido de mtNOS específico, consecuencia del aumento progresivo en la transcripción del gen nNos, así como también de la translocación y actividad de la proteína (Fig. 1 y Fig. 2). Una disminución en la actividad de MnSOD con la edad (Fig. 6) contribuyó a un aumento final en la producción de H2O2 (Fig. 3) que con un NO máximo reacciona con el anión superóxido para la formación de ONOO-. Esto condujo a la nitración de las proteínas mitocondriales en las ratas más viejas (Fig. 4). La nitración del complejo I, disminuyo su actividad al 60% (Fig. 5). En animales jóvenes, la actividad de Sirt3 es significativamente menor que en los animales de 18 meses. Así como la adición de ONOO- a mitocondrias jóvenes aumenta la actividad de esta desacetilasa (Fig.7). WB con anticuerpos 3NO-Tyr confirmaron la nitración de proteínas a los 24 meses (Fig. 4). A su vez se confirmó un desbalance en la relación de concentración NAD/NADH en la vejez con un aumento significativo de las cantidades de NAD disponible (Fig. 8), que explican el aumento en la actividad de Sirt3 en mitocondrias de ratas de 18 meses. Concluimos que en la vejez, el control de la expresión/localización de nNOS es afectado por el reloj de la vida, y que un aumento de NO mitocondrial conduce a la nitración de proteínas y a la oxidación de NADH con una ganancia inicial y un deterioro final de las funciones de SirT3