rirt

MIRANDA, CRISTIAN G.; SOLANA, MARIA E.; PINO MARTINEZ, AGUSTINA M.; CURTO, MARIA A.; LAMMEL, ESTELA; SCHIJMAN, ALEJANDRO; ALBA SOTO, CATALINA D.

Mar del Plata

Otro; LIX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica y LXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2014

El tratamiento actual de la enfermedad de Chagas se basa en la administración de dos compuestos: benznidazol y nifurtimox. Estas drogas presentan una eficacia del 80% sólo cuando son utilizadas en la etapa aguda de la infección. Además, presentan efectos secundarios que a veces requieren de la interrupción del tratamiento. Para el desarrollo de terapias más efectivas y seguras es necesario implementar métodos para evaluar potenciales drogas en los estadíos parasitarios relevantes en la infección humana. Desarrollamos una cepa transgénica de T. cruzi que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) transfectando con el vector integrativo pTREXgfp la cepa de T. cruzi K98 perteneciente al linaje TcI. Verificamos que el parásito transgénico K98GFP es fluorescente en los estadíos epimastigote, tripomastigote metacíclico, tripomastigote sanguíneo y amastigote intracelular. La expresión de GFP es estable (alrededor del 80%) en todos los estadíos in vitro y en el modelo murino, en ausencia de drogas de selección. Además, comprobamos que conserva las características biológicas de la cepa nativa. Con ella desarrollamos un ensayo in vitro basado en citometría de flujo para evaluar simultáneamente la actividad amastigoticida y el índice de selectividad de compuestos. En el ensayo infectamos la línea celular J774 con tripomastigotes sanguíneos de K98-GFP en una MOI 5:1 en placas de 96 pocillos por triplicado. Luego de 4 hs de cultivo a 37°C en CO2, se eliminaron los parásitos que no ingresaron a las células y se inició la administración diaria de los fármacos. Al cabo de 72 hs de cultivo a las células cosechadas se las tiñó con ioduro de propidio y se las adquirió en citómetro de flujo analizando la presencia de eventos en los canales FL1 y FL2. Estos ensayos permitirán el tamizaje in vitro de un mayor número de fármacos y proporcionarán una herramienta rápida y precisa que agilizará su evaluación en modelos in vivo y posteriormente en ensayos clínicos.