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Objetivo: Analizar el efecto del consumo L. casei en el desarrollo de la enterocolitis por Salmonella utilizando un modelo murino de infección. M&M: Bacteria: Se utilizó la cepa salvaje de Salmonella enterica serovariedad Enteritidis #5694 (S. Enteritidis) para infectar a los ratones. La bacteria fue cultivada en TSB (trypticase soy broth) a 37ºC, con 200 revoluciones por minuto, luego se centrifugó y fue resuspendida a la densidad apropiada en solución salina. En todos los casos el número de bacteria fue determinado por plaqueo en diluciones correspondientes en trypticase soy agar. Animales: En todos los experimentos se utilizaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de vida. Generación de enterocolitis: los animales fueron pretratados vía oral con 20 mg de estreptomicina (Sigma Aldrich). Veinticuatro horas después los ratones se inocularon vía intragástrica (ig) con 1000 unidades formadoras de colonias (UFC) de la cepa salvaje colocando una sonda PC-50. A diferentes tiempos se tomaron muestras del intestino para estudios histológicos y para estudios de PCR a tiempo real. Administración del probiótico: leche fermentada con Lactobacillus casei DN- 114001 de uso comercial (Danone S.A.) fue utilizada durante este estudio. La misma fue administrada de manera ad libitum, como descripto anteriormente (3) durante 7 días consecutivos anteriores a la infección por S. Enteritidis. Los ratones ingirieron en promedio la dosis de 1 x 108 UFC de L. casei por día. Grupos experimentales: 1: EC: recibieron estreptomicina y Salmonella; 2: L. casei + EC: recibieron Lactobacillus casei, estreptomicina y Salmonella; 3: Control: animales sin tratar; y 4: L. casei + Strep: ratones que recibieron únicamente el probiótico y estreptomicina. Colonización bacteriana y persistencia: A los tiempos indicados post infección, los ratones fueron sacrificados y las cargas bacterianas analizadas. Todas las placas de Peyer localizadas en el intestino grueso (6 a 8) y un tercio del bazo fueron removidas asépticamente de cada animal y homogeneizadas en solución salina estéril. Las colonias similares a Salmonella se plaquearon en agar SS y luego en agar TSI (triple-sugar-iron) y testeadas para el antígeno somático O9. Estudios histológicos: Los tejidos fueron incluidos al menos 24 horas en paraformaldehido 4%. Luego de embebidos en parafina, se hicieron cortes de 4 micrones y las tinciones fueron hechas con hematoxilina y eosina (H&E). PCR a tiempo real: Los tejidos de rodilla fueron procesados de inmediato, en frio, para la extracción de ARN. Los tejidos intestinales fueron congelados a -80Oc hasta el momento de la extracción. A partir del ARN se obtuvo ADNc, el cual fue usado para los experimentos realizados en un ciclador Applied Biosystem 7500. Los resultados fueron analizados con 7500 System SDS Software. Permeabilidad Intestinal in vivo: la permeabilidad intestinal fue determinada midiendo la cantidad de FITC- dextran en sangre luego de su administración oral como se describió previamente (13). Análisis estadístico: las diferencias significativas entre grupos experimentales fueron determinadas por análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguida de test de Tukey para múltiples comparaciones. Los valores de P de menos de 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Resultados Analizamos el efecto del consumo de L. casei sobre la respuesta inflamatoria a la enterocolitis (EC) inducida por S. Enteritidis. Los grupos de animales estudiados fueron: 1: EC: recibió estreptomicina y Salmonella; 2: L. casei + EC: recibió Lactobacillus casei, estreptomicina y Salmonella; 3: Control: animales sin tratar; y 4: L. casei + Strep: ratones que recibieron únicamente el probióticos y estreptomicina. Cuarenta y ocho horas luego de la infección, los animales del grupo EC presentaron signos de enfermedad, incluyendo diarrea, pelos erizados y letargia. Encontramos que S. Enteritidis induce una enterocolitis difusa, caracterizada por un epitelio disminuido en altura, con infiltrado mononuclear en la mucosa y submucosa y perdida de la arquitectura normal de las vellosidades. La administración de L. casei durante una semana previa a la infección, previno los cambios histológicos (grupo L. casei + EC) así como también la aparición de los síntomas clínicos. El efecto protectivo de L. casei observado en el epitelio intestinal y a nivel clínico puede estar relacionado a la disminución de la invasión bacteriana observada en el grupo L. casei + EC. Nuestros resultados claramente indican que la consumición de L. casei drásticamente disminuye la invasividad de S. Enteritidis y acorta su persistencia en el bazo. El epitelio intestinal preservado y la disminución en la invasividad inducida por L. casei se correlacionaron con un 100% de sobrevida en animales del grupo L. casei + EC. Aproximadamente 20% de los ratones con enterocolitis por Salmonella mueren hacia el día 7 post infección (8). Sin embargo, no ocurrieron muertes entre animales pertenecientes al grupo que ingirió L. casei. Ha sido demostrado que la permeabilidad intestinal decrece durante la enterocolitis (7). Para investigar el efecto de L. casei en la permeabilidad intestinal durante la enterocolitis por Salmonella, administrados una dosis única de FITC?dextran con una jeringa a los animales a los dos días post infección y medimos la intensidad de la fluorescencia en suero 5 horas después. El aumento de la permeabilidad intestinal a las macromoléculas inducido por Salmonella (grupo EC) disminuyo a los niveles observados en ratones controles en animales alimentados con L. casei previo a la enterocolitis (grupos Control y L. casei + EC). Rápido luego de la infección intestinal, S. enterica induce un aumento significativo en la expresion de IL-17 y citoquinas relacionadas tales como TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-23 (5, 8). Encontramos que los animales alimentados con el probiótico (grupo L. casei + EC) no respondieron a la infección con el patógeno, ya que la expresión de IL-17 y de las citoquinas relacionadas a la misma fue similar a la observada en ratones no infectados. Este efecto anti- inflamatorio generado por L. casei fue mas dramático en el ganglio mesenterio. Conclusión Aquí demostramos que el consumo de L. casei previo a la infección intestinal impide la enterocolitis generada por Salmonella; el porcentaje de sobrevida, la invasividad y persistencia de Salmonella mejoraron. A su vez, los cambios histológicos y el aumento en la permeabilidad intestinal se evitaron. En el presente trabajo expusimos que el consumo de L. casei previene la respuesta intestinal de IL-17, entre otras citoquinas, frente a Salmonella. En un trabajo previo (8), nosotros determinamos que la neutralización de la IL-17 sistémica inhibía la generación de enterocolitis. Luego de la infección por Salmonella el eje IL-23/IL-17 es gatillado en la mucosa intestinal. Los macrófagos y células dendríticas infectadas con Salmonella son una fuente potencial de IL-23, una citoquina que ayuda a amplificar la respuesta inflamatoria en el tejido intestinal. Así, la IL-23 producida por los fagocitos, estimula a las células T a secretar IL-17 (5). Diferentes subtipos de células T, como Th17, γδ y NKT, presentes en la mucosa y lamina propia intestinal expresan el receptor para IL-23 y son una importante fuente de IL-17 durante la infección por Salmonella (5, 11). Las células Th17, γδ y NKT han sido implicadas como generadoras de IL-17 en diferentes modelos de inflamación (4). Por el otro lado, la diferenciación de las células Th17 y células T γδ requiere de un ambiente especifico de citoquinas el cual incluye IL-1β, IL-6 IL-23 y TGF-β (2). Aquí, mostramos que la expresión de estas citoquinas es inducida durante la enterocolitis por Salmonella y que se impide mediante la consumición de L. casei. Nuestros resultados sugieren que la consumición de L. casei altera el microambiente necesario para la diferenciación de las células inmunes