IMPAM   23988
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA MEDICA
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
ESTANDARIZACIÓN DE UNA TÉCNICA ARTESANAL DE EXTRACCIÓN DE ADN EN MATERIA FECAL PARA DIAGNÓSTICO DE STRONGYLOIDES STERCORALIS.
Autor/es:
REPETTO, SILVIA ANALIA; ALBA SOTO, CATALINA D; TEKIEL, VALERIA; GONZALEZ-CAPPA, STELLA MARIS
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; LVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica LX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; 2012
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Investigación Clínica
Resumen:
El diagnóstico de Strongyloides stercoralis (Ss) es por observación directa de larvas en heces (H) por métodos convencionales y cultivo en agar nutritivo (CAN). Su sensibilidad es baja y por ello las técnicas moleculares son útiles. Éstas utilizan kits comerciales para la extracción de ADN que no siempre son eficientes para nematodes por su estructura cutícular y los inhibidores presentes en las H. Nosotros estandarizamos un método artesanal (MetArt) de extracción de ADN para una PCR diagnóstica de Ss en H. Aquí comunicamos la sensibilidad analítica (SA) de la PCR utilizando como templado ADN obtenido por el MetArt comparado con un kit comercial. MATERIALES Y METODOS: Para determinar la SA se purificó ADN de muestras con 1 larva/ gH utilizando en paralelo el MetArt y un kit comercial. Para el 1ro. las muestras se incubaron en GTES (glicina, SDS, Tris/HCL, EDTA) con posterior lisis mecánica por congelación/ descongelación – sonicación. Luego se incubaron en buffer de lisis (EDTA, NaCl, Tris y SDS, proteinasa K) y realizó extracción con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y precipitación con etanol 100%. La pureza del ADN se estableció por espectrofotometría. La PCR se realizó con un cebador dirigido contra el gen 18S de rRNA de Ss y como templado diluciones en diez de las muestras de ADN obtenidos por ambos métodos. Luego se evaluó la PCR en H de17 pacientes con diagnóstico de estrongiloidosis por CAN. RESULTADOS: El límite de detección de la PCR fue de 10-2 larvas /gH cuando el ADN se extrajo con el MetArt y de 1larva /gH con el kit comercial. Para ambos la relación 260/280 fue 1,7-1,8. La PCR fue positiva en los 17 pacientes con el templado de ADN artesanal y solo en 7 cuando se utilizó el ADN obtenido por el kit comercial. CONCLUSIONES: El tratamiento de las muestras con GTES y posterior lisis mecánica y química permite obtener ADN de calidad para efectuar una PCR altamente sensible para evaluar pacientes con sospecha de estrongiloidosis. Financiado por UBACyT