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Parásitos transgénicos para el descubrimiento de nuevas drogas contra Trypanosoma cruzi. Catalina D. Alba Soto y Maria Elisa Solana. La enfermedad de Chagas afecta alrededor de 8 millones de personas América latina y más de 100 millones se encuentran en riesgo de contraer la infección en el continente. Las campañas de eliminación del insecto vector en áreas endémicas y el desplazamiento de pacientes infectados hacia los centros urbanos de Latinoamérica y otros continentes modificaron su habitual escenario rural. Su distribución actual muestra un escenario urbano de transmisión. A poco más de una centuria de su descubrimiento, la OMS la incluye entre las enfermedades ?desatendidas?. El tratamiento farmacológico de la enfermedad de Chagas se basa en la administración de 2 compuestos heterocíclicos: benznidazol (derivado nitro-imidazólico) y nifurtimox (derivado 5-nitrofurano). Estos muestran una eficacia significativa (80%) cuando son administrados en la infección aguda etapa en la que la negativización de los ensayos parasitológicos y serológicos son considerados marcadores de cura. La misma eficacia no se observa en ciertas áreas geográficas probablemente debido a diferencias genéticas de las poblaciones de T. cruzi circulantes. Considerando la fase crónica, la eficacia del tratamiento antiparasitario se halla actualmente en discusión. Su evaluación requiere del seguimiento de la evolución clínica de los pacientes durante períodos prolongados para documentar que evita el desarrollo de daño cardíaco y/o digestivo, las formas graves de la enfermedad de Chagas crónica. En esta etapa, la falta de marcadores de cura parasitológica constituye un obstáculo fundamental para establecer la eficacia de las drogas. Tanto el benznidazol como el nifurtimox provocan efectos adversos gastrointestinales, neurológicos, hematológicos y dermatológicos que aparecen con mayor frecuencia en pacientes adultos. El hallazgo de nuevas alternativas terapéuticas más eficaces y seguras, basado en el conocimiento profundo de la biología del parásito y su interacción con el hospedero, resulta un desafío actual(2). Para ello es imprescindible establecer nuevos sistemas de evaluación de drogas tanto in vitro como in vivo que resulten informativos, rápidos y reproducibleS. Los candidatos terapéuticos más promisorios se basan en la acción sobre distintos blancos parasitarios, entre ellos: inhibidores de la síntesis del ergosterol (posaconazol y ravuconazol); inhibidores de la cruzipaína que es la principal cisteín-proteasa parasitaria necesaria para su mutiplicación; bifosfonatos que actúan como inhibidores específicos de hexokinasa ATP-dependiente; análogos estables del pirofosfato que actúan mediante la inhibición de la farnesyl-pyrophosphato sintetasa o hexoquinasa parasitaria; inhibidores de la síntesis de la tripanotiona y del metabolismo redox parasitario; inhibidores de la hipoxantin-guanin-fosforibosil transferasa, enzima clave en la síntesis de purinas de T. cruzi), análogos de fosfolípidos que actuarían inhibiendo la síntesis de fosfatidilcolina y esfingomielina parasitarias así como compuestos inhibidores de las prolina-racemasas parasitarias y otros. Dedicados esfuerzos se han invertido también en estudiar productos naturales vegetales cuyos principios activos presentan actividad tripanocida. Entre ellos se destacan algunos flavonoides, sesquiterpeno-lactonas, lignanos y alcaloides. En muchos casos su obtención requiere complejos protocolos de purificación y se desconoce su mecanismo de acción. En la última década se han conformado distintas bases públicas de compuestos con posible actividad parasiticida detectada en ensayos de alto rendimiento tanto por compañías farmacéuticas o la academia. Bibliotecas on-line como Collaborative Drug Discovery, PubChem o ChEMBL-Neglected Tropical Diseases ofrecen información inicial sobre estos compuestos y la posibilidad de continuar su estudio para el desarrollo de futuras drogas. T.cruzi es un parásito con múltiples estadios que desarrolla su ciclo evolutivo entre el insecto vector y el hospedero mamífero. Las formas presentes en el vector son epimastigotes (duplicativos) y tripomastigotes metacíclicos (no-duplicativo); estos últimos infecta al mamífero durante la transmisión vectorial. En el mamífero, los tripomastigotes invaden células nucleadas y se diferencian a amastigotes, estadios de multiplicación intracitoplasmáticos. Los tripomastigotes constituyen la forma infectante en la transmisión congénita y transfusional. Tradicionalmente los ensayos para evaluar la actividad tripanocida de nuevos compuestos se han realizado con el estadío epimastigote dada su fácil propagación en medios de cultivo axénicos. Sin embargo, la información obtenida resulta insuficiente ya que no puede extrapolarse a las formas parasitarias presentes en el hospedero mamífero. Actualmente resulta indiscutible que para el tamizaje de nuevos compuestos deben usarse los estadíos tripomastigote y amastigote. Estudiar la actividad amastigoticida in vitro es particularmente relevante pues aporta información sobre la acción del nuevo compuesto pero también sobre la interacción de la droga con la célula hospedera que pueda limitar su disponibilidad intracitoplasmática o favorecer su citotoxicidad. En todos los casos es necesario elegir líneas celulares patrón, poblaciones parasitarias y definir parámetros farmacológicos como concentración inhibitoria e índice de selectividad. Estos métodos requieren de un trabajo intenso y son difíciles de automatizar pues convencionalmente se evalúa la actividad de la droga por conteo bajo microscópio de tripomastigotes y/o amastigotes intracelulares previa tinción, inmuno o radiomarcación. Se sugiere que un compuesto pase a la fase de testeo in vivo en el modelo animal solo si ha demostrado actividad tripanocida in vitro con un alto índice de selectividad. Los ensayos in vivo se basan en el estudio de la eficacia de nuevos compuestos en modelos murinos de infección aguda por T. cruzi comprobando la reducción de parasitemia y/o aumento de sobrevida. Sin embargo, estos parámetros no garantizan erradicación de la infección, la cual debería ser evaluada por ausencia de reactivación luego del tratamiento inmunosupresor. La principal desventaja de este abordaje es el tiempo prolongado para obtener resultados (aprox. 80 días). Este modelo experimental presenta múltiples variables a considerar en su interpretación como cepa, edad y sexo del ratón usado para la infección asi como cepa y inóculo de T. cruzi y tiempos de evaluación post-tratamiento. Es importante además que los compuestos demuestren actividad parasiticida frente a distintos aislamientos de T. cruzi con diferentes características genéticas y susceptibilidad a drogas de referencia. En suma, para poder evaluar un sustancial número de candidatos se requieren herramientas de simple manipulación y que permitan cuantificar en forma reproducible a los parásitos y que reflejen en forma adecuada su interacción con la célula huésped y/o el modelo animal. En décadas pasadas se desarrollaron parásitos recombinantes que expresan genes reporteros. Estos le confieren al parásito un fenotipo que permite distinguirlos de su entorno, deben ser inertes y en lo posible no deben afectar la fisiología del parásito y deberían estar ausentes en el hospedero. Estos parásitos transgénicos han facilitado considerablemente el tamizaje de compuestos antiparasitarios. La tecnología reportero es más sensible que los métodos clásicos ya que permite la detección de bajos niveles de parásitos aún en condiciones intracelulares. Algunos de los genes reporteros empleados hasta el momento codifican para enzimas catalíticas como luciferasa, β-galactosidasa, cloranfenicol acetil-transferasa o para proteínas fluorescentes. Para lograr la expresión de estos genes reporteros en T. cruzi se desarrollaron y optimizaron diferentes vectores de expresión que llevan una copia de estos genes reporteros de manera episomal o se integran al genoma en locus definidos.