Efectos de la yema de huevo y sus fracciones sobre los espermatozoides de cerdo durante el proceso de criopreservación.

HUARTE M.; MARTÍNEZ SARRASAGUE, M.; CIMATO, A.; SUHEVIC, J.; BALZER, A.; CISALE, H.; PIEHL, L.

Mar del Plata

Congreso; XII Congreso Nacional de Producción Porcina, XVIII Jornadas de Actualización Porcina y VII Congreso de Producción Porcina del Mercosur.; 2014

INTRODUCCIÓNLa crio-capacitación de los espermatozoides es un proceso deletéreo que se desarrolla durante la criopreservación de estas células. Se lo denomina así debido a que ocurren cambios semejantes a la capacitación espermática, tales como fosforilación en tirosina de las proteínas y eflujo de colesterol de su membrana con el consecuente aumento en su fluidez. En los espermatozoides de cerdo la crio-capacitación está altamente favorecida debido a la extremadamente baja relación colesterol/fosfolípidos y la alta fluidez de su membrana. Como consecuencia, no se han logrado resultados satisfactorios en la congelación de los espermatozoides de esta especie. La yema de huevo es uno de los aditivos más usados al congelar espermatozoides en la mayoría de las especies, y suele adicionársele Equex-Paste, con acción detergente. Con el objetivo de mejorar la congelación de los espermatozoides de cerdo, en el presente trabajo se propone evaluar el efecto de las diferentes fracciones de la yema de huevo durante la criopreservación sobre la calidad espermática, la fosforilación en tirosina de las proteínas y la fluidez de membrana de estas células.MATERIALES Y MÉTODOSEl semen fue diluido 1:2 en diluyente Androstar® Plus y estabilizado durante 2 h a 17 ºC (T0). Luego de ello, la muestra fue centrifugada (15 min, 1000 g) a 17ºC y los espermatozoides resuspendidos, a una concentración de 1,5 x109 células/ml, en: 1) diluyente Androstar® Plus solo, 2) diluyente Androstar® Plus adicionado con 20% de yema de huevo, 3) fracción soluble de la yema al 20 % y 4) fracción insoluble de la yema al 20 %, estas dos últimas obtenidas por centrifugación (30 min, 10000 g) a partir de la preparación 2). La temperatura de las muestras fue disminuida de 17 ºC a 5ºC en un intervalo de 2 h (T1). Se diluyó luego a concentración 1,0 x109 células/ml con el aditivo correspondiente adicionado con 0,5 % Equex-Paste y 3% glicerol, y se incubó 30 min a 5ºC (T2). Se evaluaron los espermatozoides en las distintas etapas del proceso (T0, T1 y T2) mediante: motilidad, vitalidad, test hipoosmótico, integridad acrosomal, fosforilación en tirosina de las proteínas por Western blot y fluidez de membrana mediante el parámetro de orden S determinado por Resonancia de Spín Electrónico (ESR) usando como marcador de spín el ácido 5-doxil esteárico inserto en la bicapa lipídica de la membrana.RESULTADOSAl evaluar el estado de los espermatozoides en las distintas condiciones ensayadas se observó una disminución significativa de la motilidad en las células tratadas con diluyente solo y con la fracción insoluble de la yema tanto en T1 como en T2. La vitalidad y el test hipoosmótico sólo disminuyeron significativamente con estos diluyentes en T2, mientras que la integridad acrosomal no fue afectada en ninguno de los casos.Los estudios de proteínas fosforiladas en tirosina mostraron la aparición, en T1 y T2 respecto de T0, de una banda fosforilada de peso molecular 32 kDa (p32) en los espermatozoides incubados con diluyente Androstar® Plus solo, mientras que en aquellos incubados con la fracción soluble de la yema al 20 % no se observó la aparición de dicha banda. En los espermatozoides tratados con yema 20 % y con la fracción insoluble de la yema se detectó una alta cantidad de proteínas fosforiladas constitutivas de la yema, aún cuando los espermatozoides fueron separados por la técnica de swin-up y posteriormente lavados, lo cual no permitió evaluar sus efectos.Para los estudios de fluidez de membrana se prosiguió entonces, sólo con el agregado de la fracción soluble de la yema. Se observó que dicha fracción no modificó la fluidez de la región hidrofílica de la membrana de los espermatozoides, determinada mediante el parámetro de orden S. Sin embargo, luego del agregado de Equex-glicerol se observó en T2 una disminución significativa de dicho parámetro, lo cual indica un aumento en la fluidez.DISCUSIÓNLa yema completa es el aditivo habitualmente usado para congelar espermatozoides de cerdo y de muchas especies con resultados variables. En el presente trabajo se propone analizar el efecto de dos fracciones de la preparación de yema 20 % obtenidas por centrifugación. Se observó que la fracción soluble de la yema tiene un efecto protector ya que inhibió la fosforilación en tirosina y mantuvo la fluidez de membrana de los espermatozoides durante su enfriamiento de 17 a 5 ºC. Por otra parte, se observó que la fracción insoluble de la yema tiene un efecto perjudicial sobre los espermatozoides, efecto que fue exacerbado por el agregado de Equex-glicerol. Si bien el agregado de este último aditivo no modificó la calidad de los espermatozoides tratados con la fracción soluble de la yema, sí aumentó la fluidez de su membrana.Se concluye que tanto el uso de la fracción soluble de la yema como evitar del uso de detergentes, pueden ser alternativas para el mejoramiento de los protocolos de criopreservación en cerdo con el fin de estabilizar su membrana y evitar la crio-capacitación.BIBLIOGRAFÍA1. Bravo, M. y col. Changes in tyrosine phosphorylation associated with true capacitation and capacitation-like state in boar spermatozoa. Mol. Reprod. Dev., may 2005, vol.71, p. 88-96.2. Green, C. y col. Comparison of the capacitation-like state of cooled boar spermatozoa with true capacitation. Reproduction, dic. 2001, vol. 122, p. 889-898.3. Kumaresan A. y col. Quantification of kinetic changes in protein tyrosine phosphorylation and cytosolic Ca²⁺ concentration in boar spermatozoa during cryopreservation. Reprod Fertil Dev., 2012, vol. 24, p.531-42.4. Piehl L. y col. Biochemical characterization and membrane fluidity of membranous vesicles isolated from boar seminal plasma. Anim Reprod Sci., may 2006, vol. 92, p. 401-10.