Interacción funcional entre el complejo I y la enzima NOS mitocondrial (mtNOS)

BOMBICINO SS; IGLESIAS DE; ZAOBORNYJ T; BOVERIS A; VALDEZ LB

Montevideo

Jornada; Segundas Jornadas de +Biofísica, Seccional Biofísica Uruguaya; 2013

Seccional Biofísica Uruguaya

El complejo I mitocondrial es una complejo multiproteico localizado en la membrana mitocondrial que cataliza la transferencia de electrones desde el NADH hasta la ubiquinona, y es el sitio principal de entrada de sustratos a la cadena respiratoria. El complejo I no solo produce O2- por la auto-oxidación de la flavina-semiquinona, sino que además es sensible a especies reactivas oxidantes y nitrantes. El óxido nítrico (NO) inhibe la actividad del complejo I por S-nitrosilación y Fe-nitrosación. En la mitocondria, el NO es sintetizado por la enzima mtNOS, localizada en la membrana interna mitocondrial. Trabajos anteriores han reportado una asociación entre la mtNOS y la subunidad Va de la citocromo oxidasa (Persichini y col.)1. Posteriormente, Franco y col. 2 mostraron que no solo el complejo IV sino también el complejo I co-inmunoprecipitan con la mtNOS, sugiriendo una interacción física directa entre duchas proteínas. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la interacción funcional entre el complejo I y la mtNOS utilizando partículas submitocondriales invertidas (SMP o ETPH-Mg2+), las cuales exponen a la enzima NADH deshidrogenasa y a la mtNOS al medio externo. Las SPM mostraron una actividad NAD+ reductasa de 14.4±0.9 nmol/min.mg proteína, sostenida por el flujo reverso de electrones de la cadena respiratoria cuando se adicionan succinato y ATP. Esta actividad fue inhibida ante el agregado de inhibidores de la cadena respiratoria (rotenona 88%; antimicina 77%), desacoplantes (m-CCCP 93%) o inhibidores de la ATPsintasa (oligomicina 98%). Las SMP sintetizan NO a una velocidad de 0.62±0.03 nmol/min.mg protína en óptimas condiciones experimentales (0.5 mM MgCl2, 0.3 mM KCN). La actividad de mtNOS ensayada por flujo reverso de electrones fue detectada (99%) aún en ausencia de NADPH, un dador exógeno de electrones, sugiriendo que la producción de NO podría sustentarse también por electrones derivados de la cadena de electrones. La rotenona inhibió la actividad de la mtNOS (86%), sin embargo no inhibió la actividad de la enzima nNOS aislada, indicando que el efecto inhibitorio observado sobre la producción de NO por las SMP podría deberse a la inhibición del flujo de electrones y no por una acción directa sobre la enzima. The dependence of mtNOS activity on metabolic state and membrane potential, and the physical interaction among mtNOS, cytochrome oxidase and complex I proteins, support the hypothesis that mtNOS could interact with complex I proteins using electrons derived from the respiratory chain for its enzymatic activity