ESTUDIOS DE ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE BIOPOLIMEROS NATURALES

DOLCINI, G; PEREZ, S. E; MORÁN, P

2020-05-15/2021-07-01

Química

Salud humana

Se realizaron estudios de actividad antiviral para responder a los objetivos del PROYECTO. IP COVID19 ? 612. Desarrollo de geles, films y recubrimientos poliméricos para la elaboración de materiales de protección y de inactivación del COVID-19 de distintas superficies. Dirección: Dra. Verónica LassalleBIOPOLÍMEROS ANALIZADOS1. Gel Q-Cu 0,125%-Ag 0,125%2. Gel Q-Cu 0,25%-Ag 0,25%3. Gel Q-Cu 1%4. Solución Q en ácido cítrico5. Gel Q (en ácido cítrico)-Cu 0,5%6. Gel Q (en ácido cítrico)-Cu 0,5%.b.Se evaluó actividad antiviral para alfaherpesvirus bovino 1 (BoHV-1, cepa Cooper) y coronavirus bovino (BCoV, cepa Mebus), un betacoronavirus al igual que SARS-CoV2. La preparación de stock virales y los ensayos de titulación se realizaron en células Madin-Darby bovine kidney (MDBK) y en células de adenocarcinoma rectal humano (HRT-18), las cuales son el sustrato adecuado para la replicación de BoHV-1 y BCoV, respectivamente. Los títulos virales se determinaron por titulación en microplaca mediante el método de Reed y Muench (1938) y se expresaron como DICC50/ml. Los títulos de los stocks virales fueron de 107 DICC50/ml para BoHV-1 y de 106,73 DICC50/ml para BCoV y para los ensayos ambos virus se utilizaron a una concentración de 105 a 106 DICC50/ml. Para la preparación de los stock virales y titulación de BCoV se utilizó medio de cultivo sin suero fetal bovino al que se le adicionó tripsina 0,05%.Para la determinación de la actividad antiviral se realizaron los siguientes ensayos por triplicado.A . ENSAYO DE ADSORCIÓN (BINDING).Mediante este ensayo se evalúa la capacidad de los biopolímeros naturales de adsorber los viriones de BoHV-1 y BCoV.Para los ensayos con BoHV-1 los biopolímeros se evaluaron sin diluir (210 µl) y en diluciones seriadas de 10-1 a 10-3 (210 µl). Las diluciones se realizaron en medio de cultivo (MEM) y luego se adicionaron 40 µl de virus a la concentración previamente mencionada. La adsorción se realizó a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos. Luego de una centrifugación a 16,000 g por 5 minutos se colectó el sobrenadante para aislamiento viral y titulación en células MDBK en caso de observarse efecto citopático (ECP).De acuerdo a los resultados obtenidos con BoHV-1, para los estudios con BCoV se evaluaron únicamente los biopolímeros 2 y 4 sin diluir (210 µl) y en diluciones 1:3 y 1:5. Las diluciones se realizaron en medio de cultivo (MEM/F12) y luego se adicionaron 40 µl de virus a la misma concentración evaluada para BoHV-1 y se continuó con el mismo protocolo. El aislamiento viral y titulaciones se realizaron en células HRT-18.B. ENSAYO DE DESADSORCIÓNMediante este ensayo se evalúa la capacidad de los biopolímero de retener los viriones adsorbidos luego de un tratamiento con un agente desadsorbente, en este caso el cloruro de sodio.De acuerdo a los resultados obtenidos en el ensayo A (adsorción), para el estudio de desadsorción se evaluaron los biopolímeros sin diluir y en diluciones 10-1 y 10-2, según el siguiente procedimiento. Luego de la adsorción con 40 µl de BoHV-1 durante 30 minutos, con agitación, como se describió para el ensayo A y de una centrifugación a 16,000 g por 5 minutos se lavó el pellet 3 veces con PBS y se agregaron 250 µl de cloruro de sodio 2M. Se procedió a un período de 30 minutos de desadsorción, con agitación y luego se colectaron 100 µl de sobrenadante, se centrifugó a 16,000 g por 5 minutos y se tituló el sobrenadante. Como control del ensayo se incluyeron una mezcla de BoHV-1 con cloruro de sodio 2M y BoHV-1 sin la adición de cloruro de sodio.