La activación de los receptores tipo toll 3 y 7 induce protección y la expresión de catelicidinas en células de pulmón fetal bovino infectadas con herpesvirus bovino tipo 1 y 5

BURUCÚA, M; PEREYRA, S; MARIN, M; PEREZ, S. E; LEUNDA, M; POUZO, L; ODEÓN, A

Salta

Jornada; XI Reunión de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria; 2018

AAIV

Los herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) y 5 (BoHV-5) son alfa-herpesvirus estrechamente relacionados. Si bien BoHV-1 es uno de los principales virus asociados con enfermedad respiratoria y BoHV-5 es el agente causal de meningoencefalitis necrotizante no supurativa en terneros, su asociación con los síndromes respectivos no resulta definitiva dado que pueden ser aislados de condiciones clínicas muy similares. La activación de receptores tipo toll (TLRs) estimula una respuesta antimicrobiana mediante el incremento en la expresión de péptidos de defensa como las catelicidinas, que a su vez podrían servir como ligando endógeno de los TLRs para modular su propia expresión y producción de citoquinas. Sin embargo, los mecanismos de cooperación que subyacen a ambos, TLRs y catelicidinas, induciendo defensas innatas permanecen indefinidos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la activación de los TLR3 y TLR7 sobre la replicación viral y expresión de catelicidinas en un cultivo primario de células de pulmón fetal bovino infectadas con BoHV-1 o BoHV-5. Para ello, monocapas confluentes de las células sembradas en placas de 24 pocillos fueron estimuladas con agonistas sintéticos del TLR3 (Poly (I:C), 10 µg/mL) y TLR7 (Imiquimod, 5 µg/mL). Luego de 1 h, las monocapas fueron infectadas con las cepas de referencia Cooper de BoHV-1 o N569 de BoHV-5 (MOI: 0,1). A las 6 y 24 h post- infección (hpi) se recolectaron los sobrenadantes y se determinaron los títulos virales mediante el método de Reed y Müench. Además, se extrajo el ARN total con Trizol de las células de los distintos tratamientos y se estudió la expresión génica de la catelicidina BMAP28 mediante RT-qPCR. Las diferencias estadísticas entre los títulos virales se calcularon analizando las interacciones entre virus, agonistas sintéticos y tiempo de infección. Se realizaron seis repeticiones y se compararon las medias cuadradas mínimas del logaritmo de dichos títulos con la prueba t-test (opción PDIFF) del procedimiento MIXED de SAS, empleando un nivel de significancia de 0,05. El análisis de expresión relativa se realizó con el software REST, utilizando el gen GAPDH como control. No se observaron diferencias (p ≥ 0,05) entre los títulos virales de ambos virus en las distintas hpi. El tratamiento con ambos agonistas tuvo un efecto antiviral, observándose una disminución significativa (p ≤ 0,05) en la replicación viral en células tratadas con Poly (I:C) (102,99 TCID50/mL) con respecto al control (103,94 TCID50/mL) a las 6 hpi y en células tratadas con Poly (I:C) (105,5 TCID50/mL) e Imiquimod (105,4 TCID50/mL) con respecto a células control no tratadas (106,6 TCID50/mL) a las 24 hpi. En general, BMAP28 fue detectada en los diferentes tratamientos evaluados. Si bien la infección por BoHV-1 y BoHV-5 incrementó la expresión génica de la catelicidina 4 veces con respecto al control, no fue significativo (p ≥ 0,05). La estimulación de los cultivos con Poly (I:C) o Imiquimod indujo la expresión de BMAP28 (p ≤ 0,05) en células infectadas durante 24 h con BoHV-1 (86,9 veces) o BoHV-5 (27,3 veces), respectivamente. Concluimos que Imiquimod y Poly (I:C) inducen protección e incremento en la expresión de BMAP28 en células de pulmón fetal bovino infectadas con BoHV-1 y BoHV-5. Trabajos previos han demostrado que la estimulación con agonistas sintéticos de los TLRs inhiben la replicación herpesviral. Además, se ha observado que la expresión de catelicidinas está estrechamente regulada a través de diferentes mecanismos implicando principalmente la activación de los TLRs. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en este trabajo donde se observa que los tratamientos con Imiquimod y Poly (I:C) disminuyen significativamente la replicación viral junto con un aumento en la expresión génica de BMAP28. Por lo tanto, resultaría útil ampliar el conocimiento sobre la modulación de la respuesta inmune innata dada por TLRs, catelicidinas y sus vías de señalización en infecciones por BoHV