Desarrollo de un modelo in vitro para el estudio de la patogenicidadde Campylobacter fetus sobre espermatozoides bovinos

CAGNOLI CLAUDIA; ALLER JUAN; CATENA MARIA

Tandil

Jornada; Primeras Jornadas de Investigación y posgrado.; 2018

FCV. UNCPBA. Secretaría de Posgrado

La patogenia de la campylobacteriosis genital bovina ha sido estudiada mediante el empleo de modelos experimentales in vivo e in vitro. Entre los primeros se utilizaron bovinos, ratones y cobayos. En los modelos in vitro el efecto de Campylobacter se midió sobre la fertilización, las células vaginales y uterinas bovinas, los embriones murinos y los espermatozoides ovinos. En espermatozoides bovinos se demostró que Campylobacter fetus fetus (CFF) y Campylobacter fetus venerealis (CFV) tienen la capacidad de adherirse pero aún no se determinó su patogenicidad.El objetivo de este trabajo fue desarrollar un modelo in vitro para evaluar la patogenicidad de ambas subespecies de Campylobacter sobre los espermatozoides bovinos.En el modelo se utilizaron pajuelas de semen bovino criopreservado. Los espermatozoides, previa centrifugación a 200g, fueron resuspendidos en medio SOF (Synthetic Oviductal Fluid) con heparina para realizar las mediciones iniciales (Hora 0). Posteriormente fueron divididos de la siguiente manera: grupo control, grupo inoculado con CFF y grupo inoculado con CFV. Las cepas bacterianas criopreservadas fueron cultivadas durante 48 h en medio Skirrow, a 37 ºC y una atmósfera de 10% de CO2, 5% de O2 y saturación con N2. Se prepararon suspensiones de las colonias con una DO660nm 0,14 (1,1x108 UFC/mL) y los inóculos se realizaron mediante diluciones (relación bacteria: espermatozoides de 2:1).La incubación se realizó durante 24 h en estufa con 5% de CO2 a 38 ºC. Los parámetros evaluados fueron: vitalidad espermática, integridad y funcionalidad de la membrana plasmática, integridad del ADN (Hora 0 y 24), reacción acrosómica y porcentaje de espermatozoides con Campylobacter adherido (Hora 24).La vitalidad espermática y la integridad de la membrana se midieron mediante la coloración vital eosina nigrosina en platina térmica, con observación en microscopio óptico (40X). La funcionalidad de la membrana se midió mediante el test hiposmótico (HOST), con observación en microscopio de campo oscuro (40X). Para evaluar la integridad del ADN se utilizó el test de la dispersión de la cromatina (SCD). Los espermatozoides, en una matriz de agarosa, fueron tratados con una solución ácida para desnaturalizar el ADN y posteriormente se utilizaron soluciones de lisis para remover las membranas y proteínas. El efecto fue visualizado con tinción DAPI en microscopio con luz azul (40X). La reacción acrosómica fue observada mediante la tinción Trypan-blue / Giemsa. La adhesión de Campylobacter se determinó con Giemsa 10%. Ambas observaciones se realizaron en microscopio óptico a 100X (inmersión).Los resultados preliminares observados indican que CFV y CFF tienen alto grado de adhesión a espermatozoides con efecto sobre los parámetros de vitalidad espermática, integridad y funcionalidad de la membrana plasmática y reacción acrosómica, no así en la integridad del ADN. Ambas subespecies tendrían un comportamiento similar.El presente modelo demuestra ser apto para el estudio de la patogenicidad in vitro de ambas subespecies de Campylobacter fetus.