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IntroducciónTritrichomonas foetus (T. foetus) es el agente causal de la Trichomonosis venérea bovina. El principal mecanismo de patogenicidad es la adherencia a células del tracto reproductor y posterior daño tisular. Las proteasas extracelulares, de las cuales las cisteinproteasas (CPs) son las de mayor importancia en la patogenia de T. foetus, juegan un rol importante en las interacciones entre el huésped y el protozoario tales como la virulencia, adherencia, adquisición de nutrientes y en los procesos de la inflamacion. También favorecen al protozoo a evadir la respuesta inmune debido a la degradación de IgA e IgG localizadas en vagina y útero respectivamente. Este mecanismo permite una mayor resistencia del protozoario y en determinadas y contribuir a la persistencia de la infección en las hembras.Muchos autores realizaron estudios genéticos de estas CPs y reportaron la secuencia de ADN de la CP8 de T. foetus (Lucas et al. 2008). La comparación de las secuencias de amino acidos y nucleotidos de la CP8 de T. foetus aisladas de bovinos y de felinos revelaron variaciones o polimorfismo nucleotidicas entre ellas. (Sun et al. 2012). Hasta el momento, aunque se han reportados múltiples CPs las más importantes secretadas por T. foetus son la CP30 y la CP8, estas proteasas producen citotoxicidad y apoptosis de células epiteliales vaginales y uterinas y también en diferentes líneas celulares. Durante nuestros trabajos sobre la caracterización patogénica y molecular de diferentes aislamientos de T. foetus, hemos observado variabilidad sobre el efecto citopático en líneas celulares CHO entre los aislamientos (Doumecq et al.2012). Por lo tanto, teniendo en cuenta el rol patogénico de las CP nos planteamos como objetivo caracterizar el gen que codifica CP8 en los diferentes aislamientos de T. foetus mediante PCR y evaluar si existe polimorfismo en el promotor del gen para dicha enzima mediante secuenciación. Materiales y métodosNuestro cepario de T. foetus está conformado por 102 aislamientos de raspajes prepuciales de toros de distintos partidos de la provincia de Buenos Aires. Para los ensayos de caracterización patogénica y molecular fueron seleccionados 25 aislamientos de 13 partidos diferentes de la provincia de Buenos Aires. Extracción del ADN: se tomó 1 ml del cultivo, se realizaron dos lavados con PBS a 1500 G durante 10 minutos. El pellet en una concentración de 500.000 Tf/ml fue resuspendido en agua destilada, incubado a 100°C y tratado con proteinasa K. Luego de centrifugar, el sobrenadante (ADN templado) fue conservado a -20°C. Los primers utilizados para caracterizar el gen de la CP8 fueron F56-CGCATCCTGCGCTTATTATC y R6-GTCCATACGGAAACCAAGGA que amplifican 235 pb GenBank: EF610628.1. El Mix de reacción de PCR fue: buffer Taq 1x, MgCl2 2.5 mM, dNTPs 0.2 mM, primer F 0.2 µM, primer R 0.2 µM, gelatina 0,01%, Taq 0.5U y 2,5 µl de ADN. La amplificación del ADN fue realizada con el siguiente programa: incubación inicial de 4 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C 40s, hibridación a 60°C 40s y extensión a 72°C 40s. La amplificación fue concluida con una extensión final de 5 minutos a 72°C. Los amplicones fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1,27% a 70V, coloreados con GelRed y observados con transiluminador UV.Para el segundo objetivo se seleccionaron 4 aislamientos con diferente grado de efecto citopático sobre línea celular CHO y de distinta región geográfica:AislamientoEf. citopáticoRegión geograficaTR 52moderadoChascomúsTR 67bajoAzulTR 83moderadoAyacuchoTR 113altoSaliquelóLa extracción de ADN y el mix de reacción para la PCR se realizaron con la metodología mencionada anteriormente. Los primers para amplificar el promotor de la CP8 fueron F-GTGGAAG TTTCTTCGTTCTTGAAGT y R-ATGCGAGGGAAGCAAGAACT que amplifican 459 pb. La región amplificada comprende 421 nucleótidos del promotor y 28 nucleótidos del primer exón. Programa de amplificación: incubación inicial de 4 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos de desnaturalización a 94°C 40s, hibridación a 54°C 40s y extensión a 72°C 40s. La amplificación fue concluida con una extensión final de 10 minutos a 72°C. Para separar los amplicones se utilizó la metodología comentada anteriormente. La secuenciación se realizó en el laboratorio IGEVET (La Plata). Las secuencias se revisaron con el programa BioEdit. Secuencia de referencia: publicada en GenBank MLAK01000623.1 correspondiente al genoma de Tritrichomonas foetus strain K, scaffold_226. ResultadosLos 25 aislamientos amplificaron una banda de 235 pb correspondiente a la presencia del gen de la CP8.Entre los aislamientos secuenciados no se encontraron polimorfismos genéticos siendo las cuatro aislamientos idénticos a la secuencia reportada en GenBank.Discusión y conclusiónUna búsqueda y alineamiento de secuencias de la región codificante del gen CP8 publicadas en GenBank demostró la ausencia de polimorfismos genéticos en los genotipos bovinos de T. foetus. Con el fin de ampliar la zona previamente reportada de este relevante gen se secuenciaron 421 nucleótidos correspondientes a la región promotora, sin embargo no se hallaron polimorfismos genéticos en los aislamientos secuenciados de las distintas regiones estudiadas. Hasta el momento, la información obtenida indicaría que las variantes fenotípicas encontradas como el diferente grado de desprendimiento de la monocapa en la línea celular CHO no estarían originadas por variantes alélicas del gen CP8.Bibliografia-Doumecq M.L.; Monteavaro, C.; Soto, P.2012. Variación del efecto citopático entre diferentes cepas de Tritrichomonas foetus sobre línea celulares CHO. XIX Reunión Científico Técnica de la AAVLD, CABA - -Lucas,J.; Hayes, G.; Kalsi, H.; Gilbert, R.; Choe,Y.; Craik, C.; Singh,B. 2008. Characterization of a cysteine protease from Tritrichomonas foetus that induces host-cell apoptosis. Arch Biochem Biophys.15;477(2):239-43-Sun,Z.; Stack,C.; ?lapeta, J.; 2012. Sequence differences in the diagnostic region of the cysteine protease 8 gene of Tritrichomonas foetus parasites of cats and cattle. Vet Parasitol. 186, 445-449