Evaluación de semen congelado/descongelado

CABODEVILA, J.

Tandil

Congreso; 4to. Congreso Internacional de Tecnologías Embrionarias; 2018

Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias

4to Congreso Internacional en Tecnologías EmbrionariasTandil - Provincia de Buenos Aires, Argentina27 y 28 de Septiembre de 2018Evaluación de semen congelado/descongeladoCabodevila, J.Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBAjcabo@vet.unicen.edu.ar1.IntroducciónLa Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNCPBA ofrece al sector productivo un Servicio de Evaluación de Semen congelado/descongelado, destinado principalmente a la especie bovina. La demanda por el mencionado servicio proviene de centros de inseminación artificial nacionales, distribuidores de semen importado y colegas de la actividad privada. El Servicio se puso en funcionamiento en 1992 y en función de la demanda, en su actividad pueden puede diferenciarse dos etapas: La primera que abarcó prácticamente una década, se caracterizó por el procesamiento de un bajo número de muestras. El análisis de semen no era habitual en la práctica veterinaria y por lo general, el profesional responsable de un programa de inseminación artificial, decidía analizar el semen cuando había ejecutado un programa de inseminación y no había logrado los resultados de preñez esperados. La segunda etapa vigente en la actualidad, tuvo sus orígenes a partir del desarrollo de los programas de inseminación artificial a tiempo fijo (IATF; Bó et al., 2002). Si bien la inseminación artificial es una biotecnología de primera generación (Thibier, 1990), en nuestro país su difusión, especialmente en producción de ganado de carne, es relativamente reciente. La IATF cambió la modalidad de trabajo, tornó habitual la inseminación de 300-400 vientres en un día, eso trajo aparejado la conveniencia de evaluar la calidad del semen, previo a la ejecución de los programas de inseminación y se vio reflejado en el volumen de trabajo de todos los laboratorios que efectúan análisis de semen (Dalton, 2013). En nuestro caso, durante los últimos 15 años hemos evaluado un promedio de 800 partidas anuales de semen congelado/ descongelado. 2.Metodología de trabajoEn nuestro Servicio, el solicitante puede optar por realizar sólo un espermograma o complementar el mismo con un análisis bacteriológico y/o virológico, limitado a IBR y BVD. La actividad se desarrolla teniendo en cuenta ciertas premisas básicas, por ejemplo, que el semen congelado no es un producto uniforme en lo que respecta a su calidad, que dicha cualidad puede verse afectada durante las etapas de distribución y/o almacenamiento y fundamentalmente que ningún examen in vitro tiene alta correlación con la fertilidad. Cabe entonces la pregunta: ¿Por qué es conveniente evaluar el semen antes de realizar la inseminación? Porque existen prueba de laboratorio que, bien realizadas y correctamente interpretadas, permiten identificar partidas con las que seguramente no se obtendrán buenos porcentajes de preñez.Dicho esto, hay que reconocer que en la evaluación de semen se han detectado diferencias entre laboratorios y aún dentro de un mismo laboratorio. Posiblemente la causa de dicha variabilidad sea la falta de entrenamiento adecuado, diferencias en los métodos de evaluación utilizados y en el equipamiento disponible para tal fin (Brito, 2016). En nuestro Servicio, el espermograma se lleva a cabo siguiendo la metodología de trabajo propuesta por Barth (1990) que incluye la valoración de tres parámetros, ellos son: Motilidad post-descongelación, morfología espermática y número de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis inseminante. 2.1.Motilidad post-descongelación Se determina mediante el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva y el vigor espermático. El daño a la membrana puede no ser completamente expresado inmediatamente después de la descongelación. Por ello, el semen debe ser incubado a 37ºC durante 2 horas. Esta evaluación es conocida como prueba de termorresistencia o de incubación. Dicha prueba puede ser realizada de distintas formas. En nuestro laboratorio, descongelamos 2 pajuelas simultáneamente. A la hora 0, vaciamos el contenido de una de ellas en un tubo de vidrio que contiene un volumen de solución fisiológica equivalente al de la pajuela, procediendo de inmediato a evaluar la motilidad progresiva y el vigor espermático. La otra pajuela permanece en el baño María y es diluida en el momento de efectuar las determinaciones correspondientes a la hora 2. El porcentaje de motilidad progresiva y el vigor son determinados inmediatamente después de descongelado el semen y luego de 2 horas de incubación. Diversos métodos pueden ser utilizados para determinar motilidad. Cuando se cuenta con experiencia, generalmente se realizan estimaciones visuales rápidas, sin efectivamente contar células. Una gota de semen delgada y uniforme es colocada entre porta y cubreobjeto tibios procediendo a evaluar a 200 aumentos el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva y luego, el vigor (tasa de progresión). Éste, se cuantifica utilizando una escala creciente de 0 a 5.El semen de buena calidad, que ha sido recientemente descongelado, normalmente tiene 40-50% de espermatozoides con motilidad progresiva y un vigor de 3-4. Después de 2 horas de incubación, estos valores generalmente disminuyen un 10-15% y 1 punto, respectivamente.Si bien la prueba de termorresistencia ha sido cuestionada como predictora de fertilidad (Vianna et al., 2009), sigue siendo utilizada a los efectos de evaluar diferentes sistemas de congelación (Saragusty et al., 2009; Ribeiro Dias et al., 2018) y de conservación del semen (Buranaamnuay et al., 2016). Las normas para motilidad exigidas en nuestro laboratorio son las definidas por el Departamento de Medicina del Rodeo y Teriogenología de la Universidad de Saskatchewan, Canadá. A la hora 0 post-descongelación, debe haber como mínimo 25% de espermatozoides con motilidad progresiva y un vigor de 3. A las 2 horas, se acepta que dichos valores desciendan a 15% y 2, respectivamente.La motilidad post-descongelación generalmente aparece comprometida en aquellos casos donde se ha producido algún inconveniente en la conservación del semen. En nuestro Servicio de Evaluación de Semen, periódicamente se registran casos en que se solicita dicha evaluación al comprobarse que, por descuido o accidente, el termo ha quedado sin nitrógeno líquido por algún período más o menos prolongado. También hemos comprobado que la motilidad post-decongelación suele verse afectada en aquellos casos en que el análisis revela un elevado grado de contaminación con microorganismos inespecíficos que si bien son incapaces de provocar una enfermedad reproductiva, pueden afectar la viabilidad de los espermatozoides al competir con ellos por el oxígeno y los nutrientes (Callejas et al., 2006; Tvrdá et al., 2018).2.2.Morfología espermáticaEl concepto de defectos primarios y secundarios sirve bien para evaluar la aptitud reproductiva de un toro pero no para predecir la fertilidad de cierta partida de semen congelado. Cabe recordar que por definición, un defecto primario es aquel que se origina durante la espermatogénesis dentro del testículo y un defecto secundario, el que se origina dentro del epidídimo o en el laboratorio.Blom (1977) introdujo un sistema de clasificación en defectos mayores y menores. Un defecto mayor es aquél que presente en gran número, ha sido asociado con infertilidad. Los defectos menores son desviaciones que hasta que surgió el mencionado sistema no habían sido asociadas con infertilidad. Este sistema de clasificación es abierto y se modifica a medida que avanza el conocimiento. Una clasificación en defectos compensables y no compensables fue propuesta por Saacke et al., 1994. Los espermatozoides con defectos compensables son aquellos incapaces de alcanzar el oviducto o de participar del proceso de fertilización. Tales espermatozoides tendrían poco efecto sobre la fertilidad, si se insemina con un número suficiente de espermatozoides aptos. En cambio, los espermatozoides con defectos no compensables (cráteres y vacuolas nucleares -defecto diadema-) acceden al óvulo como los espermatozoides normales, son capaces de penetrar la zona pelúcida y desencadenar la reacción cortical impidiendo la entrada de otros espermatozoides. La presencia de este tipo de defectos suele ser causa de baja fertilidad dado que, luego de la fertilización, se desarrollan embriones de mala calidad que mueren durante los primeros días de gestación.Si bien cada nueva clasificación parece más apropiada que la anterior, cuando se evalúa la morfología espermática surgen siempre interrogantes tales como: ¿Qué tipo de modificación en la estructura de los espermatozoides es realmente una anormalidad y si constituye una causa significativa de infertilidad?En nuestro Servicio, la morfología se evalúa en preparados húmedos, utilizando microscopio de contraste de fases. A tal fin, se mezclan una gota de semen y otra equivalente de solución fisiológica formulada al 1% y se la observa entre porta y cubreobjetos a 1000 aumentos, utilizando objetivo de inmersión. Cuando no existen problemas mayores, un conteo de 100 células es satisfactorio. Cuando un gran número de defectos espermáticos está presente, hasta 500 células deben ser contadas para obtener un espermograma preciso. Se exige un 70% de células normales.Los sistemas de producción in vitro de embriones han contribuido a una mejor comprensión de los efectos de distintos defectos espermáticos sobre la fertilidad. Barth et al. (2003) congelaron semen que cumplía con los criterios de aprobación en los diferentes parámetros, a excepción de la proporción de espermatozoides morfológicamente normales y luego lo utilizaron in vitro, procediendo a evaluar las tasas de fertilización, clivaje y desarrollo hasta el estadio de blastocisto (Tabla 1).Tabla 1. Porcentajes de fecundación, clivaje y desarrollo embrionario hasta blastocisto en un sistema de producción in vitro de embriones, utilizando semen con distintas alteraciones morfológicas (Modificado de Barth et al., 2003). FecundaciónClivajeBlastocistoPiriforme (85%)Control (89% normales)657248a74b3029Acrosoma indentado (72%)Control63a85b56a94b24a52bGota citoplasmática proximal (89%)Control17a69b8a64b0a44b (a,b: P