DESARROLLO DE UNA PCR EN TIEMPO REAL PARA DETERMINAR LA CARGA PROVIRAL EN ANIMALES INFECTADOS CON EL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA.

MARTINEZ CUESTA, LUCIA; DOLCINI, G. L; LENDEZ, P.A; NIETO FARIAS, M.V; CERIANI, M.C

San Salvador de Jujuy

Jornada; XXI Reunion Cientifico Tecnica Asociacion Argentina de Veterinarios de Diagnostico; 2016

Asociacion Argentina Veterinarios de Laboratorios de Diagnostico

INTRODUCCION: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus ampliamente distribuido en los tambos de nuestro país (1). El virus infecta principalmente linfocitos B y la transmisión ocurre por contacto con células infectadas. La mayoría de los animales infectados permanecen asintomáticos, pero en algunos casos la enfermedad progresa a linfocitosis persistente o linfosarcoma (2). Los animales infectados pueden desarrollar alta o baja carga proviral. Los animales de alta carga proviral serían más eficaces en la transmisión del virus por la gran cantidad de linfocitos infectados circulantes en sangre que poseen. Las pérdidas económicas producto de la infección son muy importantes, de ahí la relevancia del problema y la necesidad de identificar a los animales con baja carga proviral para intentar disminuir la tasa de transmisión (3). OBJETIVO: Desarrollar un ensayo de cuantificación absoluta por PCR en tiempo real (qPCR) utilizando SYBR Green para detectar la carga proviral en linfocitos de sangre periférica, amplificando una región altamente conservada del gen pol. MATERIALES Y METODOS: Se realizó una cuantificación absoluta del gen pol en animales infectados con serología positiva y PCR convencional negativa para el virus del BLV. Para elaborar la curva de calibración se utilizaron como estándar diluciones seriadas del plásmido pBLV913 en agua. El plásmido pBLV913, que contiene una copia completa del virus (gentileza de la Dra G. Buehring, University of California, Berkeley), se usó para transformar bacterias TOPO10 y luego se purificó usando un kit comercial (Axygen, Biosciences). La concentración de ADN plasmídico se midió en el equipo NanoDrop 2000 Spectophotometer (Thermo Scientific). Se construyó una curva estándar con diluciones del plásmido conteniendo de 106 a 10 copias del virus. Cada punto de la curva se amplificó por triplicado y la eficiencia de amplificación se determinó mediante un modelo de regresión lineal de acuerdo a la ecuación E = 10[-1/slope] (4). La curva estándar se validó repitiendo al menos 3 veces la amplificación. RESULTADOS: Figura 1: Curva estándar Ct (Threshold cycle) vs número de copias. y = -3,104 x + 37,043. R2: 0,945.Se analizaron veinte animales con serología positiva/PCR convencional negativa para BLV. En estos animales, el ensayo de cuantificación absoluta por qPCR permitió determinar el número de copias del provirus que resultó ser menor a 100 copias. En base a estos resultados se consideran de baja carga proviral aquellos animales que tengan menos de 100 copias del provirus cada 30 ng de ADN de células mononucleares de sangre periférica. El punto de corte se determinó de forma arbitraria.CONCLUSIONES: Los animales con serología positiva y PCR convencional negativa se consideran de baja carga proviral. Con este ensayo se pueden discriminar a los animales infectados en alta y baja carga proviral con buena especificidad y sensibilidad. La metodología desarrollada permite detectar hasta 10 copias del virus por reacción. BIBLIOGRAFIA:1.Giraudo J. et al. Bovine Enzootic Leukosis, Sitio Argentino de Producción Animal 2010.2.Gillet N. et al. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. Retrovirology 2007 4:18. 3.Bartlett P.C., et al. Options for the control of bovine leukemia virus in dairy cattle. J Am Vet Med Assoc 2014 244:914-922.4.Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Reserch 2001; 29(9).