Desarrollo de un ensayo de cuantificación absoluta por PCR en tiempo real para detectar infección por virus de la leucosis bovina

MARTINEZ CUESTA, LUCÍA; DOLCINI, GUILLERMINA; LENDEZ, PAMELA A.; NIETO FARÍAS, M. VICTORIA; CERIANI, CAROLINA

San Salvador de Jujuy

Otro; XXI Reunión Científico Técnica "Dr. Bernardo Jorge Carrillo" Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico; 2016

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

INTRODUCCION: El virus de la leucosis bovina (BLV) es un retrovirus ampliamente distribuido en los tambos de nuestro país (1). El virus infecta principalmente linfocitos B y la transmisión ocurre por contacto con células infectadas. La mayoría de los animales infectados permanecen asintomáticos, pero en algunos casos la enfermedad progresa a linfocitosis persistente o linfosarcoma (2). Los animales infectados pueden desarrollar alta o baja carga proviral. Los animales de alta carga proviral serían más eficaces en la transmisión del virus por la gran cantidad de linfocitos infectados circulantes en sangre que poseen. Las pérdidas económicas producto de la infección son muy importantes, de ahí la relevancia del problema y la necesidad de identificar a los animales con alta carga proviral para intentar disminuir la tasa de transmisión (3). OBJETIVO: Desarrollar un ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando SYBR Green para detectar la presencia del BLV en linfocitos de sangre periférica, amplificando una región altamente conservada del gen pol. MATERIALES Y METODOS: Se realizó una cuantificación absoluta del gen pol en animales infectados con serología positiva y PCR convencional negativa para la infección con BLV. Para elaborar la curva de calibración se utilizaron como estándar diluciones seriadas del plásmido pBLV913 en agua. El plásmido pBLV913, que contiene una copia completa del virus (gentileza de la Dra G. Buehring, University of California, Berkeley), se usó para transformar bacterias TOPO10 y luego se purificó usando un kit comercial (Axygen, Biosciences). La concentración de ADN plasmídico se midió en el equipo NanoDrop 2000 Spectophotometer (Thermo Scientific). Se construyó una curva estándar con diluciones del plásmido conteniendo de 105 a 10 copias del virus. Cada punto de la curva se amplificó por triplicado y la eficiencia de amplificación se determinó mediante un modelo de regresión lineal de acuerdo a la ecuación E = 10[-1/slope] (4). La curva estándar se validó repitiendo al menos 3 veces la amplificación. RESULTADOS: Se analizaron veinte animales con serología positiva/PCR convencional negativa para BLV. El ensayo de cuantificación absoluta por qPCR permitió detectar un bajo número de copias del virus (