Evaluación genético metabólica de la sobreexpresión de Glutatión S- Transferasa en aislamientos de Fasciola hepatica resistentes a Triclabendazole.

3. FERNÁNDEZ V., CADENAZZI G., ESTEIN S.M., SOLANA V., LUCCHESI P., SOLANA H.

Panamá

Congreso; XXV Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias (PANVET); 2016

PANVET

EVALUACIÓN GENÉTICO METABÓLICA DE LA SOBREEXPRESIÓN DE GLUTATIÓN S-TRANSFERASA EN AISLAMIENTOS DE F. hepatica RESISTENTES A TCBZVanesa Fernández1a; Gabriela Cadenazzi 2a; Silvia Estein3a,; Victoria Solana4a; Paula Lucchesi 5a; Hugo Solana6a.La Fasciolosis es una zoonosis parasitaria producida por Fasciola hepatica siendo Triclabendazole (TCBZ) el antihelmíntico de elección. Su mal uso ha provocado la manifestación de resistencia antihelmíntica siendo necesario ampliar los conocimientos del metabolismo detoxificativo del trematodo. Dentro del mismo las Glutatión S-Transferasas (GSTs) actúan conjugando el xenobiótico con glutatión endógeno, son el principal sistema de desintoxicación de Fase II y en F. hepatica representan un 4% del total de proteína soluble incluyendo 8 (ocho) isoenzimas diferentes. En nuestro laboratorio se compararon las actividades metabólicas de GST total en aislamientos de F. hepatica sensibles y resistentes a TCBZ (TCBZ-S y TCBZ-R) demostrándose que la actividad citosólica es aproximadamente 50% más efectiva en las GST correspondientes a aislados TCBZ-R. Cuando analizamos diferentes isoenzímas de la familia GST se detectó que mu GST no solo está implicada en los fenómenos de detoxificación sino que además se sobreexpresa participando activamente en el fenómeno de resistencia antihelmíntica. Debido a que dicha sobreexpresión podría deberse a modificaciones genéticas (mutación) o al aumento de la disponibilidad de GSTs activas en la célula; se midió por PCR convencional la expresión del RNAm de GST de TCBZ-S y TCBZ-R detectándose 1,5 mayor expresión del ARNm correspondiente a fasciolas TCBZ-R orientando esto a una probable causa de la sobreexpresión metabólica. Al aislar y secuenciar el gen correspondiente a la mu GST de F. hepatica TCBZ-S y TCBZ-R se detectó en TCBZ-R una mutación T143S de tipo polimorfismo de nucleótido único postulándose dicha mutación como una probable causa de la sobreexpresión metabólica. El objetivo del presente trabajo fue clonar, producir y purificar la mu GST recombinante de ambos aislamientos evaluando en forma comparativa la verdadera participación de la mutación T143S en el aumento de expresión enzimática. Para ello se subclonó la secuencia completa de la isoenzima mu GST de F. hepatica de ambos TCBZ-S y TCBZ-R. Se evaluó su expresión en E. coli BL21 (DE3) transformada. Una colonia de c/u se inoculó en un medio con antibiótico incubándola a 37°C a 200 rpm. Se realizó la inducción con IPTG colectando las células por centrifugación. Los sedimentos celulares se sonicaron y centrifugaron, el sobrenadante se fraccionó y tamizó en un filtro de 0,22 µ. La concentración de proteínas se determinó mediante la técnica Bradford con BSA como estándar. Las mu GST recombinantes (mu GSTr) recuperadas de ambos aislamientos se visualizaron como una única banda por SDS-PAGE y Western blot utilizando los protocolos correspondientes para las determinaciones de peso y pureza moleculares. La actividad metabólica de mu GSTr de ambos aislamientos (n=9) se determinó mediante el método descripto por Habig et al., 1974, y se analizó estadísticamente con InStat3. La actividad para la mu GSTr de F. hepatica del aislamiento TCBZ-S fue de 10510 ±32 nmol/min/mg mientras que para TCBZ-R fue de 10506 ±47 nmol/min/mg por lo que no manifestaron diferencias significativas y se puede concluir que la mutación T143S en F. hepatica TCBZ-R no estaría involucrada en la actividad funcional de la enzima descartando su implicancia en la manifestación de la resistencia antihelmíntica y reforzando la idea de una mayor sobreexpresión de enzimas disponibles por la célula. Palabras claves: Fasciolasis; Glutatión-S-Transferasa; Resistencia; Triclabendazole.