Aplicación de la técnica DAPI para la demostración de apoptosis en células CHO coincubadas con Tritrichomonas foetus

DOUMECQ , M.L.; MONTEAVARO C.; CACCIATTO C.; ECHEVARRÍA HM,; SOTO, P.

Tandil

Congreso; IX Reunión Argentina de Patología Veterinaria; 2014

Asociación Argentina de Patologia Veterinaria

Tritrichomonas foetus es un protozoario flagelado que causa la trichomonosis bovina. Esta enfermedad ocasiona pérdidas económicas al disminuir el número de terneros nacidos anualmente por mortalidad embrionaria y/o abortos. En las hembras bovinas T. foetus coloniza el área cervico vaginal y útero. El protozoario produce enzimas extracelulares, principalmente cisteínproteinasas (CP) las cuales podrían desencadenar un proceso de apoptosis en las células mediante la activación en cascada de la caspasa 3.Singh y col. (2004) en ensayos in vitro han demostrado que T. foetus produce apoptosis en las células del epitelio vaginal bovino y otras líneas celulares. En un estudio de caracterización de diferentes aislamientos sobre línea celular CHO (chinese hamster ovary) observamos variabilidad del efecto citopático de los distintos aislamientos. Los efectos observados fueron desprendimiento de la monocapa, vacuolización de citoplasma, alteración de la morfología celular de fusiforme a redondeadas, y posible condensación de la cromatina nuclear. Una de las técnicas que se utiliza para confirmar la apoptosis es la tinción con 4?-6 diamidino-2 fenil indol (DAPI). Este colorante forma un complejo con el ADN bicatenario mostrando mayor especificidad por los cluster de bases con alto contenido de AT intercalándose el colorante entre las bases de ADN, de esta manera se observa un incremento en la fluorescencia cuando es excitado con luz UV a 460 nm. Por lo tanto el objetivo que planteamos es la utilización de la técnica de DAPI para demostrar la apoptosis en línea celular CHO luego de la coincubación con 4 aislamientos de T. foetus. Los aislamientos analizados provenían de raspaje prepucial bovino, y habían sido subcultivados en medio Diamond (TYM tryptose, yeast, maltose) con 0,5 % de agar. Cada aislamiento se cultivó en caldo TYM durante 24 - 48h, se lavó dos veces con PBS pH 7,2 estéril y se resuspendió en 1 ml de MEM (Gibco® Minimum Essential Media) con 2% de suero fetal bovino a una concentración de 1x105T. foetus/mL. El cultivo de células CHO se realizó en placas de 24 pocillos (Axygen®) con un 75-80% de confluencia. En cada pocillo, se agregó 500 μl de la suspensión de protozoarios, dejando 2 pocillos como control de la línea celular. Se incubó durante 48 h a 37 ºC con 5% de dióxido de carbono en estufa. Transcurridas 48 h se tripzinizaron los pocillos y se colocaron 5 µl en portaobjetos para inmunofluorescencia. Se fijaron con acetona a-20 ºC durante 10 minutos. Posteriormente se adicionó la solución DAPI (4´, 6-Diamidino-2-fenilindol, Invitrogen®) 1:1000. Se dejó incubar durante 5 minutos protegido de la luz y se realizaron 3 lavados con PBS de 5 minutos cada uno. Los portaobjetos fueron montados con glicerina bufferada pH 8. Posteriormente, se observó con microscopio de fluorescencia (Olympus®), luz ultravioleta, filtro de excitación UG1 puente dicroico U y filtro barrera L420. Se contaron las células correspondientes a 20 campos con aumento 400X. Se registró el porcentaje de células con núcleos normales, células con citoplasma y cromatina nuclear condensada y compactada hacia un extremo, alteración de la membrana nuclear y presencia de cuerpos apoptóticos. El promedio de células registradas por campo fue de 2,73 ± 0,49 células El porcentaje de células con núcleos normales en el control fue de 40 % mientras que para los pocillos con los 4 aislamientos de T. foetus fue de 8; 9; 33 y 5 %. El porcentaje de células con citoplasma y cromatina nuclear condensada y compactada hacia un extremo, para el control fue de 31,6 % y para los aislamientos 55,6; 59; 44 y 41,7 %. El porcentaje de células con alteración de la membrana nuclear para el control fue de 21,1 % y de los aislamientos 28,6; 31; 15 y 46,7 %. El porcentaje de cuerpos apoptóticos para el control fue 7,9% y para los aislamientos 7,9; 2; 7 y 6,7 %. Los resultados mostraron mayor porcentaje de células con núcleos normales en el control que en los pocillos coincubados con cada uno de los 4 aislamientos de T. foetus. Se observó que las células del control presentan núcleos con un porcentaje de cuerpos apoptóticos similar a los pocillos coincubados, esto puede deberse al bajo porcentaje de suero fetal bovino utilizado. Para los pocillos con T. foetus fue mayor el porcentaje de células con citoplasma y cromatina nuclear condensada y compactada hacia un extremo y en tres de las cepas fue mayor el porcentaje de células con alteración de la membrana nuclear los cuales son pasos previos a la apoptosis. La utilización de la técnica de DAPI permitió demostrar el efecto apoptótico que produce T. foetus sobre la línea celular CHO y también observar la variabilidad de las alteraciones nucleares provocadas por los distintos aislamientos de T. foetus, tal como lo habíamos descripto al observar el efecto citopático sobre esta línea celular. Si bien este es un ensayo in vitro, al igual que el trabajo de Sinhg y col (2004) probablemente este sería uno de los efectos más importantes que ocurren sobre los tejidos de huésped.