"Técnica in vitro para determinar efecto antihelmíntico de extractos de plantas sobre larvas infectantes de nematodos gastrointestinales de bovinos"

MORENO FABIANA C.; SAGÜÉS MARÍA F.; RODRÍGUEZ EDGARDO M.; PASSUCCI J.

Buenos Aires

Encuentro; XIX Reunión Científico Técnica; 2012

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnostico

INTRODUCCIÓN Varias técnicas in vitro han sido desarrolladas para evaluar el potencial efecto antiparasitario de compuestos sintetizados químicamente y para identificar cepas de nematodos resistentes a antihelmínticos. El test in vitro de inhibición de la migración con larvas infectantes (L3) ha sido ampliamente usado para estudiar la eficacia antiparasitaria de metabolitos secundarios de las plantas (MSP) y tiene la ventaja sobre los test basados en la eclosión de huevos o en el desarrollo larval en que las L3 son fácilmente disponibles, almacenables y relativamente simples de usar. El objetivo del presente trabajo fue adaptar el test in vitro de inhibición de la migración larval (IML) desarrollado por Rabel et al., (1994) al estudio de la eficacia antihelmíntica de extractos de 15 plantas autóctonas de Australia con potenciales propiedades antiparasitarias en la migración de L3 de nematodos que afectan al ganado bovino. La modificación del test posibilitó testear un gran número de muestras a bajo costo, utilizando un número reducido de L3 y temperaturas constantes de incubación, evitando el uso de agar. MATERIALES Y MÉTODOS El test in vitro de inhibición de la migración larval se basa en la habilidad de las L3 de migrar libremente a través de una malla, evaluando la reducción en la motilidad de las mismas después de ser incubadas con sustancias potencialmente antihelmínticas. Para la técnica se construyeron filtros con tubos de acrílico transparente de 20mm de largo y 7mm de diámetro interno a los que se les adhirió una malla de nylon de 20µm en uno de sus extremos. A diferencia de la técnica descripta por Rabel et al., (1994), aquí no se utilizó un anillo de goma al final del filtro, sino que se pegó cuidadosamente en el borde del tubo que contenía la malla un anillo de 1mm de espesor realizado con el mismo acrílico con que se construyó el filtro. Utilizando esta metodología se evaluó el potencial efecto antihelmíntico de extractos metanólicos de: Acacia farnesiana, Acacia melanoxylon, Acacia salicina, Acacia holosericea, Acacia favescens, Acacia leptostachya, Eucalyptus tessellaris, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus platyphylla, Eucalyptus moluccana, Eucalyptus crebra, Casuarina cunninghamiana, Callitris endlicheri, Neolitsea dealbata, Allocasuarina torulosa. El polvo de cada uno de los extractos vegetales fue disuelto en buffer fosfato (0,1M fosfato, 0,05M NaCl; pH 7,2) y diluidos a concentraciones de 5, 15 y 30mg/ml. Las L3 provenientes de cepas sensibles de Haemonchus placei y Cooperia sp. se obtuvieron de cultivos fecales mediante la técnica de Baerman y fueron mantenidas a 10ºC en frascos de cultivo hasta su uso. Para favorecer el contacto de las L3 con los extractos se utilizaron tubos eppendorf de 2ml a los cuales se les agregó 0,4ml de extracto diluido y 150 a 200 L3 envainadas suspendidas en 0,1ml de solución acuosa. Se realizaron 3 repeticiones para cada uno de los extractos de plantas y un control negativo (L3 en buffer fosfato) y un control positivo (L3 muertas por calor a 70ºC por 10min) se corrieron en paralelo. Los tubos fueron incubados a 37ºC por 17 horas. El contenido total de los tubos (0,5ml) fue luego transferido a los filtros localizados dentro de cámaras de acrílico de 1,9cm de diámetro interno construidas al efecto. Dichas cámaras con los filtros fueron incubadas a 37ºC por 17 horas para permitir a las larvas migrar a través de los filtros dentro de la cámara. Luego, los filtros fueron removidos cuidadosamente de las cámaras, previo lavado de sus paredes externas. El contenido de los filtros (larvas no migradas) fue invertido en otra cámara para favorecer el conteo. El número total de L3 en las cámaras y en los filtros fueron contados. La IML se determinó usando la siguiente fórmula: IML= (A-B/A) x 100 A = proporción de L3 migradas en el control y, B = proporción de L3 migradas en los tratamientos El porcentaje de migración larval fue analizado mediante un ANOVA con un arreglo factorial de especie de planta por concentración (SAS, 2004). Se realizaron comparaciones múltiples con la media más pequeña (CMM), detectándose subconjuntos con las mejores combinaciones planta-concentración dentro de cada una de las concentraciones evaluadas. Cuando se compararon todas las combinaciones de extractos/concentraciones se detectó un subgrupo extracto/concentración con los mejores porcentajes de IML para cada especie parasitaria. RESULTADOS La metodología empleada, nos permitió detectar interacción significativa entre los extractos de plantas y las concentraciones en cada uno de los géneros parasitarios evaluados (P