Optimización de la producción de estireno en Escherichia coli mediante la expresión de phaP.

EGOBURO, DIEGO E.; GAGNOLA, GONZALO; PETTINARI, M. JULIA

Ciudad de Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2019) XIV Congreso Argentino de Microbiología General (XIV SAMIGE) V Congreso Argentino de Microbiología de Alimentos (V CAMA) V Congreso Latinoamericano de Microbiología de Medicamentos y Cosméticos; 2019

CAM

Introducción y objetivosEl estireno, utilizado en la producción de numerosos polímeros, es actualmente obtenido por síntesis química a partir de recursos no renovables. Este compuesto puede obtenerse en microorganismos utilizando sustratos renovables a partir de una vía metabólica {de novo} basada en la conversión de fenilalanina. Esta vía implica la desaminación de la fenilalanina a trans-cinamato, catalizada por la enzima {pal} y luego una descarboxilación catalizada por la enzima {fdc}. Este sistema de producción se ve limitado por la alta toxicidad del estireno para los microorganismos. Para reducirla se han utilizado estrategias como el uso de cultivos bifásicos y el uso de chaperonas. Si las bacterias crecen en presencia de un solvente orgánico biocompatible, el estireno se extrae {in situ}, reduciendo el contacto del compuesto con las células. El uso de chaperonas mejoran la tolerancia a compuestos tóxicos como los solventes orgánicos. Recientemente se descubrió que las phasinas o PhaP, proteínas asociadas a polímeros biodegradables bacterianos (polihidroxialcanoatos o PHA), poseen actividad chaperona e incrementan la tolerancia y la producción de etanol, butanol y 1, 3-propanodiol. El objetivo principal es obtener una cepa de {E. coli} productora de estireno y estudiar el efecto de distintas modalidades de cultivo y la sobreexpresión de phaP en la producción del compuesto. Materiales y métodosPara la obtención de las cepas productoras {E. coli} BL21 fue transformada con 3 plásmidos, conteniendo los genes {pal}, {fdc} y {phaP}, provenientes de {Rhodosporidium toruloides}, {Saccaromyces cerevisae} y {Azotobacter} sp. FA8 respectivamente. En el caso de {phaP} el plásmido vacío se utilizó como control.Se realizaron cultivos aeróbicos en frasco agitado monofásicos (5 ml de medio M9 suplementado con glucosa y fenilalanina) o bifásicos (5 ml de medio + 1 ml de dodecano). Luego de inducir todas las proteínas, se dejó crecer 48 hs. Para determinar la concentración de estireno se agregó n-hexano hasta llegar a un volumen final de 2 mL de fase orgánica, en la cual se determinó la concentración por Cromatografía Gaseosa.Se realizó un ANOVA con un nivel de significancia de 0,05 y se utilizó una comparación de Tukey.ResultadosLas cepas de menor producción fueron las crecidas en cultivos monofásico, indistintamente de la presencia de PhaP en el crecimiento de las bacterias. La cepa productora sin PhaP en cultivo bifásico produjo el doble de estireno que las producciones en monofase y por último, el cultivo bifásico que expresa PhaP produjo casi 3 veces más estireno que la cepa previamente mencionada y 7 veces más que en cultivo monofásico, llegando a producir hasta 159 mg/L.ConclusiónLa combinación de estrategias utilizadas permitió obtener una muy buena producción de estireno a partir de una cepa recombinante de E. coli. En base a estos resultados prometedores se realizarán cultivos en biorreactores, donde se espera que el efecto de PhaP sea mayor.