Caracterización del sistema mTAG para la visualización de mRNAs endógenos in vivo en células en células quiescentes de Saccharomyces cerevisiae

CLARA ANDREA SOLARI; PAULA PORTELA

Workshop; RNA molecular and cellular biology workshop; 2018

El sistema mTAG consiste en el agregado de secuencias de unión (stem loops) de la proteína viral MS2 a mRNAs de interés y la co-expresión de la proteína de fusión MS2-GFP3. Recientemente, el empleo de esta técnica ha sido revisada debido a la acumulación de fragmentos 3´ de degradación del mRNA asociados anormalmente a P-bodies. En este trabajo presentamos el análisis por microscopía y Northern Blot del sistema mTAG para los mRNAs de ENO2, PDC1, MFA2 y TIF1 en células durante fase exponencial, estacionaria y post agregado de nutrientes. Analizamos el estado traduccional general de las células mediante perfiles polisomales. Nuestros resultados indican que la localización de cada mRNA-mTAG responde según la disponibilidad de nutrientes y el estado traduccional. La disminución de nutrientes promovió el arresto traduccional y la acumulación de 1-2 gránulos mRNA-mTAG/célula que no co-localizaron con P-bodies o Stress granules. El análisis de integridad de los mRNA-mTAG mostró la acumulación de fragmentos de degradación dependientes de la expresión de MS2-GFP3 sugiriendo la formación de complejos estables aberrantes 3´ mRNA-mTAG. Post reactivación traduccional, aumenta la expresión de los mRNA y cambia el patrón de agregación pero se mantiene la tasa de degradación de los mRNA. La inactivación de PKA redujo la formación de P-bodies y Stress granules en fase estacionaria. Afectó la formación de gránulos mRNA-mTAG pero no afectó la acumulación de productos de degradación.