Dengue evade la respuesta inmune intrínseca por medio de la interacción de NS5 con PML

CYBELE C. GARCÍA; PETER HEMMERICH; FEDERICO GIOVANNONI

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virologia

La inmunidad intrínseca es mediada por proteínas expresadas constitutivamente por la célula y que pueden bloquear directamente la replicación viral. Mientras que la activación de la respuesta inmune innata a través de la vía del interferón requiere de varias horas, los efectores de la inmunidad intrínseca se encuentran disponibles incluso antes de la primera interacción entre el patógeno y el huésped. De este modo, la inmunidad intrínseca es la primera respuesta frente a las infecciones virales.La proteína de la leucemia promielocitica (PML) es una de las moléculas involucradas en la inmunidad intrínseca frente a múltiples virus. PML actúa como centro organizador de estructuras nucleares conocidas como Nuclear Bodies (PML-NBs). Una gran cantidad de virus, tanto ARN como ADN, codifican en sus genomas la información para proteínas por medio de las cuales interaccionan con los PML-NBs con el objetivo de evadir la respuesta antiviral.Previamente describimos el efecto antiviral de PML contra el serotipo-2 del virus dengue (DENV). En este trabajo expandimos estos estudios y demostramos el mecanismo molecular a través del cual DENV suprime el efecto antiviral de PML.En primer lugar, estudiamos el efecto antiviral de PML frente a los 4 serotipos de DENV. En células A549, el silenciamiento de PML a través de siRNAs aumentó la producción de partículas virales de DENV entre 3 y 4 veces.A continuación, evaluamos el efecto de la infección con DENV sobre la distribución de PML-NBs. A través de microscopia confocal, observamos que la infección redujo el número de PML-NBs por núcleo celular. Confirmado este fenómeno, decidimos estudiar el mecanismo molecular responsable. Para ello, células A549 fueron transfectadas con plásmidos codificando la secuencia de las 3 proteínas con localización nuclear de DENV (C, NS5 y NS3). Imágenes obtenidas por microscopia confocal demostraron que la sola expresión de NS5 es suficiente para el desensamble de PML-NBs. Mas aún, la interacción entre PML y NS5 fue confirmada por co-inmunoprecipitación.Finalmente, dado que PML existe en múltiples isoformas (PMLI-PMLVII), evaluamos cuál de ellas es la responsable de inhibir la replicación de DENV. Estudios de co-transfección de NS5-GFP con todas las isoformas de PML-RFP, demostraron que solo PMLIII y PMLIV colocalizaron con NS5. Por último, por medio de estudios de sobreexpresión, demostramos que solo PMLIII y PMLIV presentan actividad antiviral contra DENV, reduciendo en un 60-70% la producción de partículas virales.En conclusión, mostramos la importancia de PML en la respuesta antiviral intrínseca contra DENV. Nuestros experimentos prueban que las isoformas III y IV son responsables del efecto antiviral y que la proteína NS5 de DENV antagoniza esta respuesta. Estos resultados también contribuyen a aclarar uno de los enigmas de la biología de DENV: cuál es la función en el núcleo de NS5, siendo DENV un flavivirus cuyo ciclo de replicación ocurre íntegramente en el citoplasma.