Caracterización del factor de traducción eIF4G1 como sustrato de PKA en Saccharomyces cerevisiae

CLARA ANDREA SOLARI; PAULA PORTELA

Jornada; Jornadas Interdisciplinarias de Química Biológica; 2017

La Proteína Quinasa Dependiente de cAMP (PKA) en Saccharomyces cerevisiae tiene un rol central en el control del metabolismo, en la resistencia al estrés y en la regulación de la proliferación celular. Ante la escasez de nutrientes, S. cerevisiae arresta el ciclo celular, disminuye globalmente la síntesis de proteínas e inicia la traducción vía CAP-independiente (IRES). Hemos demostrado que la PKA conecta el estado nutricional de la célula con la traducción en distintos niveles: a través de la interacción con factores de traducción, modificando la localización de sus subunidades en gránulos de mRNA, y controlando los niveles proteicos del factor de iniciación de la traducción eIF4G1 post-traduccionalmente. Análisis fosfoproteómicos reportaron que eIF4G1 es una fosfoproteína. El objetivo de este trabajo fue caracterizar a eIF4G1 como sustrato de PKA e identificar los residuos blancos de fosforilación. Para tal fin, se utilizó el sistema pGEX para expresar y purificar proteínas recombinantes GST-eIF4G1 en versión completa o fragmentada. Las proteínas recombinantes se usaron en ensayos de fosforilación in vitro con Tpk1 de S. cerevisiae y Cα de mamíferos como subunidades catalíticas. Se estudió la incorporación de γ-32P [ATP] mediante autoradiografía y western blot usando anticuerpos anti-P-Ser. Los residuos fosforilados se identificaron empleando nanoLC-MS/MS. Nuestros resultados demostraron que eIF4G1 es sustrato de PKA in vitro e identificamos la Thr934 como un residuo blanco de esta fosforilación. El residuo Thr934 se localiza en uno de los dominios de unión a RNA en el extremo C-terminal de la proteína. Por este motivo, estamos interesados en estudiar el rol de la fosforilación sobre la abundancia proteica de eIF4G1 sobre el reclutamiento del factor al complejo de pre-iniciación 43S.