IQUIBICEN   23947
INSTITUTO DE QUIMICA BIOLOGICA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
CARACTERIZACION DE UNA PROTEINA DE FUSION GLICOSILADA POR ESPECTROMETRIA DE MASA
Autor/es:
NEME TAUIL, RICARDO MARTÍN; MORENO DE COLONNA, SILVIA; FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; COUTO, ALICIA; VALACCO, MARÍA PÍA; PAROLA, ALEJANDRO
Lugar:
Rosario
Reunión:
Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometría de Masas; 2016
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Espectrometría de Masas
Resumen:
La OMS define a los biosimilares como un producto bioterapéutico que es similar en términos de calidad, seguridad y eficacia a un producto ya presente en el mercado1.Los biosimilares son proteínas recombinantes que han sido diseñadas para ser lo más parecido posible a las moléculas innovadoras, porque entre otros presentan la misma secuencia primaria, modificaciones postraduccionales similares, estructura secundaria, terciaria y cuaternaria globalmente similares y perfiles de impurezas que no difieren significativamente. Sin embargo para su registro es necesario realizar una batería de comparaciones sofisticadas, no sólo a nivel fisicoquímico sino a nivel bioquímico y que incluye ensayos in vitro e in vivo y ensayos clínicos. Cuando estos ensayos se realizan de manera comparativa constituyen un ejercicio de comparabilidad entre un innovador y un biosimilar.El innovador en cuestión es una proteína recombinante producida en células CHO. Se trata de una molécula de alto PM, con estructura compleja con 29 puentes disulfuro, y múltiples glicosilaciones de tipo N y O. Se desea determinar y verificar su secuencia primaria, la presencia de los puentes disulfuro esperados, y las glicosilacionesUtilizando herramientas de espectrometría de masa MALDI TOF TOF y Orbitrap Se realizó la caracterización de la proteína en cuanto a su masa molecular, secuencia aminoacídica y modificaciones postraduccionalesPara la determinación de masa molecular de la proteína intacta se utilizó el espectrómetro de Masa MALDI TOF TOF (Bruker Daltonics), y se verificó que coincide con la masa molecular teórica.La proteína fue deglicosilada con la enzima PNGasa que corta los enlaces N-glicosidicos, y luego con una O-glicanasa. Para el mapeo peptídico, que pretende cubrir la mayor parte de la secuencia por MS y MSMS, se realizaron digestiones enzimáticas con varias proteasas de sitio de corte específico (Tripsina, corta a la derecha de lisina y arginina; Quimotripsina, corta a la derecha de triptofano, metionina, fenilalanina, tirosina, leucina; Gluc-c, corta a la derecha de glutámico) y análisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y con nanoHPLC, acoplada a Q Exactive para lograr cobertura total de la secuencia con los péptidos identificados.Se logró una cobertura de aproximadamente un 86,3% por MS y MSMSTambién se realizaron digestiones de la molécula sin deglicosilar, con las mismas proteasas, para luego realizar un enriquecimiento en glicopeptidos por HILIC y así identificar sitios de glicosilación y poder estudiar la composición de los diferentes glicanos unidos.Luego se realizó la construcción de la base de datos de glicanos, para poder realizar la búsqueda automática de los mismos, con el software Proteome Discoverer.Se identificaron varios sitios de glicosilación esperados y otros no descriptos hasta el momento.