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Título: Estudio de los factores de virulencia y atenuación de arenavirus del Nuevo Mundo mediante el empleo de clones infecciosos. Autores: Forlenza, MB (1); Foscaldi, SA (1); Sepúlveda, CS (2); Gómez, RM (3); López, NM (1)(1)ICT Milstein-CONICET; (2)IQUIBICEN.CONICET-UBA; (3) IBBM.CCT-CONICET - LA PLATALos arenavirus del Nuevo Mundo incluyen virus patógenos para humanos como el virus Junín (JUNV), y no patógenos como el virus Tacaribe (TCRV), prototipo del grupo. Los determinantes virales que influyen en la virulencia o atenuación de JUNV no han sido completamente dilucidados. El genoma de los arenavirus consiste en dos segmentos de ARN de cadena simple (S y L), cada uno de los cuales usa una estrategia bisentido para codificar dos proteínas. El ARN S codifica para la nucleoproteína (NP) y el precursor de las glicoproteínas de envoltura (GPC), y el ARN L para la polimerasa L y la proteína matriz Z. Estudios anteriores de nuestro grupo han permitido desarrollar un sistema de genética reversa para rescatar TCRV infeccioso a partir de ADNc. En este trabajo, se utilizó el clon infeccioso de TCRV para evaluar la relevancia de un sitio de clivaje para caspasas en la Nucleoproteína (ausente en TCRV), que se ha propuesto como determinante para la capacidad de los arenavirus patógenos de inhibir la inducción de apoptosis en las células infectadas. Utilizando mutagénesis dirigida, el sitio de clivaje para caspasas fue introducido en un plásmido que expresa la NP de TCRV. Se verificó que la NP mutante es capaz de sostener la replicación del ARN viral mediante un sistema de minireplicón. Luego, la secuencia codificante de la NP mutante fue introducida en el plásmido pSag, que codifica para el segmento S de TCRV. El plásmido resultante (pSagCAS), o el pSag salvaje, fueron transfectados junto con el plásmido que codifica para el segmento L (pLag) en células BHK-T7, para generar TCRV infeccioso mutante o salvaje, respectivamente. Los sobrenadantes de cultivo de las células transfectadas fueron utilizados para amplificar la progenie viral mediante la inoculación de monocapas de células BHK21. El virus recombinante presente en los sobrenadantes fue titulado mediante el ensayo de placas. Se establecieron las condiciones óptimas para evaluar la capacidad de los virus obtenidos de inducir apoptosis en células A549 por la técnica de tinción con naranja de acridina y bromuro de etidio. Los cultivos celulares fueron infectados por 72 hs y se determinó el número de células apoptóticas presentes en cada caso. El comportamiento in vivo de los virus mutantes será analizado en un modelo animal.