Determinación de la actividad chaperona in vitro de la phasina PhbP de Pseudomonas extremaustralis

DIANA E WETZLER; DANIELA ALVAREZ; M. JULIA PETINARI; MARIELA MEZZINA

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología ALAM-CAM; 2016

ALAM-CAM

Lasphasinas son proteínas asociadas a los gránulos intracitoplasmáticos de polihidroxialcanoatos(PHA), un conjunto de polímeros biodegradables producidos por muchos génerosbacterianos. Además de su función estructural y regulatoria en la acumulaciónde polímero, nuevas funciones han sido atribuidas a estas proteínas. Tal es el casode la phasina PhaP de Azotobacter sp.FA8 (PhaPAz), para la cual se observó un efecto protector inesperadoante el estrés térmico y oxidativo en cepas de E. coli no productoras de PHA. Se demostró que dicha protecciónante el estrés se basa en la capacidad de PhaPAz de actuar comochaperona molecular, evitando la agregación de proteínas mal plegadas. Elobjetivo de este trabajo fue analizar si laactividad chaperona descripta para PhaPAz es una propiedad extensiva a otras phasinas provenientes de distintosmicroorganismos. Para ello, se trabajó con la phasina PhbP de Pseudomonas extremaustralis (PhbPPe).En estudios preliminares se había determinado que la expresiónheteróloga de phbPPeen E. colitambién produce el efecto protector ante el choque térmico observado con PhaPAz.Análisis in silico de PhbPPepredicen que la estructura secundaria estríaformada por 4 α-hélicesintercaladas entre regiones random coily que presentaría regiones desestructuradas. Con elobjetivo de obtener información experimental tanto de la estructura secundariacomo de la actividad chaperona in vitro,se produjo la proteína PhbPPe recombinante. Para ello se construyóun plásmido que permite la producción de PhbPPe fusionada a un tagde seis histidinas en el extremo amino terminal. La proteína de fusión sepurificó mediante cromatografía de afinidad sobre iones metálicos, utilizandouna columna de níquel. Paraobtener información de la estructura secundaria de la proteína realizaronexperimentos de dicroísmo circular (CD), obteniéndose un 21% de sus aminoácidosen conformación α-hélice.Con elfin de estudiar si PhbPPe presenta actividad chaperona se realizaronexperimentos de desnaturalización térmica utilizando la enzima citrato sintasa(CS). Para ello se agregó una concentración final de 0,15 μM de CS a solucionesprecalentadas a 45 °C conteniendo distintas concentraciones de PhbPPe.La agregación espontánea de la CS a 45°C fue monitoreada midiendo la dispersiónde la luz a 360nm en un espectrofotómetro con cubeta termostatizada. Losresultados demostraron que PhbPPe frena el proceso de agregación deesta enzima, a la vez que disminuye la cantidad final de agregados formados.Esto pone de manifiesto que PhbPPe posee actividad chaperona invitro. Se realizó también una comparación de la actividad chaperona entre PhbPPe y PhaPAz,encontrándose que las mismas presentan actividades muysimilares. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran que la actividad de chaperona molecular no es unacaracterística singular de PhaPAz sino que podría ser comúnentre las phasinas, y abren el camino a futuros estudios conphasinas de otros microorganismos para continuar generando evidencia a favor deesta hipótesis.