Estudio de la función de los lipid droplets en la replicación del arenavirus Junín

CECILIA ALEJANDRA VÁZQUEZ; CYBELE GARCÍA; MARÍA LAURA MORELL; JOSÉ PEÑA CÁRCAMO; SANDRA CORDO

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Encuentro; XXXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología

Estudio de la función de los lipid droplets en la replicación del arenavirus Junín. Vazquez, CA (1, 2); Peña Cárcamo JR (2); Morell ML (1, 2); García, C (2); Cordo, SM (1) 1. Laboratorio de Bioquímica y Biología del virus Junín, Departamento de Química Biológica (QB), FCEyN, UBA- IQUIBICEN, CONICET 2. Laboratorio de Estrategias Antivirales, Departamento de Química Biológica (QB), FCEyN, UBA- IQUIBICEN, CONICET Introducción El virus Junín (JUNV), perteneciente a la familia Arenaviridae, es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina. Si bien existe una vacuna para prevenirla, actualmente el único tratamiento disponible se basa en la administración de suero de pacientes convalecientes. Estudios recientes de nuestro laboratorio sugieren que en la replicación de JUNV existe una interacción entre las proteínas virales y los lipid droplets (LD). Éstos últimos son organelas involucradas en una gran diversidad de funciones. Están compuestos por un núcleo de lípidos neutros, rodeado por una monocapa de fosfolípidos. Allí se insertan diferentes proteínas, entre las que se encuentran proteínas con actividad antiviral. Sin embargo, también es un lugar utilizado por algunos virus, como dengue y hepatitis C, para replicar. Objetivo Nos propusimos estudiar el rol de los LD en la replicación de JUNV. Para ello, nuestro primer objetivo fue implementar técnicas que permitieran el estudio de estas estructuras en cultivos celulares de origen humano. Metodología Se trabajó con las líneas celulares HepG2 (hepatocarcinoma humano) y A549 (carcinoma de pulmón humano). Se trataron monocapas de células con ácido oleico durante diferentes tiempos para estimular la morfogénesis de los LD. Estas fueron fijadas y teñidas con Oil Red-O (ORO) para su análisis por microscopía. Paralelamente, el ORO retenido en los LD de células sometidas al mismo tratamiento fue solubilizado en 2-propanol para su cuantificación mediante la medición de absorbancia. Cultivos tratados con ácido oleico o con C75 (inhibidor de la síntesis de ácidos grasos) fueron infectados con una MOI de 1. Luego de 24 horas se analizaron las muestras mediante inmunofluorescencia indirecta. Se ensayaron distintos protocolos de ultracentrifugación con el objetivo de aislar LDs provenientes de monocapas de ambos tipos celulares estimulados durante 24 horas con una concentración 400uM de ácido oleico. Resultados y conclusiones Mediante la tinción con ORO se pudo verificar que el tratamiento con ácido oleico y C75 estimula e inhibe la morfogénesis de LD, respectivamente. Ensayos de inmunofluorescencia sugieren que en los cultivos infectados y estimulados la nucleoproteína viral N localizaría a nivel de estas estructuras. Mediante ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa se establecieron las condiciones de fraccionamiento subcelular que permitieron el enriquecimiento de los LD. Actualmente se está llevando a cabo la identificación de proteínas marcadoras presentes en las diferentes fracciones obtenidas. En conclusión, se lograron implementar y poner a punto técnicas para el estudio específico de los LD. Las mismas se emplearán para analizar la localización de las diferentes proteínas virales y su posible interacción con factores de restricción celulares que también se encuentran allí.