Fluoromycobacteriofagos para el testeo completo de actividad de drogas antituberculinicas.

LILIANA RONDON; MARIANA PIURI; ESTEFANIA URDANIZ; GRAHAM HATFULL; MARCELO MARTÍ

Rosario

Congreso; Congreso Latinoamericano y Argentino de Microbiologia 2016; 2016

Introducción: Los programas de screening de drogas antituberculínicas consisten generalmente en un screening de célula entera (in vitro) seguido de la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) para los mejores blancos, testeo de actividad de drogas en macrófagos (ex vivo), y finalmente, testeo en modelos animales (in vivo). Existen hoy en día variados métodos para la determinación de MIC en el testeo in vitro de actividad de drogas; sin embargo, ninguno es aplicable al testeo ex vivo, basado en el conteo de colonias en placa (muy demandante en tiempo), y mucho menos para el testeo in vivo. Es apremiante la necesidad de un ensayo rápido y sensible que pueda ser utilizado en los múltiples pasos de este proceso. Los Fluoromycobacteriófagos presentan una ventaja en la identificación rápida y sensible de Mycobacterium tuberculosis (M.tb), por microscopía de fluorescencia o citometría, y permiten a su vez una determinación simple del perfil de susceptibilidad a antibióticos.Objetivo: El objetivo primario de este trabajo consiste en diseñar un método de evaluación de actividad de drogas antituberculínicas de alto rendimiento, simple, rápido y sensible que pueda contribuir al descubrimiento de nuevas drogas mediante el uso de la nueva generación de Fluoromycobacteriófagos llamada mCherrybombɸ.Materiales y métodos: Para el testeo de actividad de drogas in vitro, se realizó la infección de M. tb con mCherrybombɸ en presencia de distintas diluciones de drogas en un formato multiwell. Se monitoreó la fluorescencia a lo largo del tiempo y se reportaron las MIC para cada droga. Para el screening ex vivo, se desarrolló un ensayo de infección en células eucariotas. Se infectaron macrófagos derivados de la línea celular THP‐1 y células de la línea de epitelio pulmonar A549 con M.tb y más tarde, se incubaron con el mCherrybombɸ. Las células se marcaron por tinción DAPI y por inmunofluorescencia con un anticuerpo anti‐LC3 marcador de autofagia, y se evaluó la presencia de bacterias intracelulares por microscopía de fluorescencia confocal.Resultados y conclusiones: Se optimizaron las condiciones de detección de M.tb por fluorimetría en formato multiwell utilizando mCherrybombɸ. Se obtuvieron las MIC correspondientes a un rango amplio de drogas utilizadas en el tratamiento de TB, haciendo factible la aplicación de la metodología para el testeo de la actividad de drogas in vitro. Los resultados se obtuvieron entre 6 y 30 horas, ya que, dependiendo el mecanismo de acción de cada droga, se requiere una incubación previa con las células. Para la evaluación ex vivo, se lograron identificar bacterias intracelulares fluorescentes en el ensayo de infección en células eucariotas pero resta evaluar cambios en presencia de diferentes concentraciones de drogas. La implementación de esta tecnología puede contribuir al desarrollo de un ensayo de screening de drogas anti‐TB rápido y de alto rendimiento.