Construcción de vectores de expresión para Lactobacillus casei.

MARIA EUGENIA DIETERLE; PROTO CASSINA LUCIANO; MARIANA PIURI

Rosario

Congreso; Congreso Latinoamericano y Argentino de Microbiologia 2016; 2016

Las bacterias ácido lácticas (BAL) han sido empleadas durante años en la industria de alimentos; se encuentran en el intestino de la mayoría de los animales, incluyendo humanos y la mayoría son consideradas GRAS (Generalmente reconocidas como seguras). Por estas características se han transformado en una excelente alternativa para el "delivery" de proteínas heterólogas. Aun hoy el mayor progreso se ha logrado en Lactococcus lactis pero las herramientas disponibles para este fin en cepas de Lactobacillus siguen siendo escasas. A diferencia de L. lactis, Lactobacillus spp tiene la capacidad de colonizar las cavidades orales e intestinales y varias cepas han sido descriptas como probióticas. Aunque se ha demostrado la funcionalidad cruzada de los sistemas de expresión y localización de proteínas entre diferentes especies de bacterias Gram positivas, se ha observado que el uso de secuencia endógenas aumenta la eficiencia de expresión y de exposición de las proteínas en la superficie celular. El objetivo de este trabajo es construir un sistema eficiente y versátil de expresión de proteínas para Lactobacillus spp. Partiendo del genoma de L. casei BL23 se amplificó un fragmento de 300 bp conteniendo la región promotora del gen l‐ldh‐1, del cual se lograron identificar las secuencias ‐10 y ‐35 y el posible sitio de unión al ribosoma (RBS). Para evaluar la funcionalidad del mismo se clonó río arriba del gen que codifica para la β‐glucuronidasa (gusA) en el vector pNZ273 y se determinó actividad utilizando como sustrato X‐Gluc. Este plásmido fue denominado pJD1. Luego se eliminó un ATG río abajo del RBS para evitar un posible inicio de la traducción desde ese codón en el mRNA correspondiente en lugar del inicio del gen de interés (pJD2). Además se optimizó la distancia entre el RBS y el gen gusA para mejorar su expresión (pJD3).Utilizando el genoma de L. casei BL23, se amplificó por PCR la región terminadora del gen l‐ldh‐1 empleando un cebador que permite el agregado de un sitio múltiple de clonado (MCS) seguido de una tag de histidinas. Este producto fue clonado rio abajo del gen gusA en el plásmido pJD3, esta construcción se denominó pJD4. En un paso posterior, se eliminó el codón STOP al final de gusA para obtener la fusión al tag de histidinas y se agregó un sitio extra de clonado para reemplazar fácilmente gusA por el gen de interés (pJD5). Luego de transformar L.casei BL23 con pJD5, la correcta expresión de la proteína recombinante se corroboró mediante ensayos de Western‐Blot utilizando anticuerpos anti‐HisTag. Finalmente para evaluar la actividad β‐glucuronidasa se realizaron ensayos de actividad utilizando X‐Gluc como sustrato.