GENERACIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE NANOANTICUERPOS PARA LA OBTENCIÓN DE MOLÉCULAS NEUTRALIZANTES DEL VIRUS DE INFLUENZA Y LA DETECCIÓN DE VIRUS DEL DENGUE.

PAREDES ROJAS; CALDEVILLA; RIVA; MATTION; GARCIA, CYBELE; IBAÑEZ

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

SAV-AAM

En 1993 una observación sorprendente informó de la existencia de anticuerpos no convencionales en miembros de la familia Camelidae. Estos anticuerpos carecían de la cadena liviana y de un dominio constante de la cadena pesada. Cuando se expresó el único dominio variable, que recibió el nombre de Nanoanticuerpo (NanoAc), se observó que el mismo conservaba una fuerte especificidad y afinidad hacia el antígeno; era soluble en medio acuoso y resistente a varios pHs y temperaturas; podía reconocer epítopes poco accesibles; se expresaba fácilmente en microorganismos y podía ser modificado mediante técnicas de ingeniería genética para mejorar sus propiedades. Hasta el momento se ha reportado el uso exitoso de NanoAcs para inhibir y detectar varios tipos de virus como VIH, HBV, Influenza, RSV, Rabia, FMDV, Poliovirus, Rotavirus, vaccinia, entre otros. En este trabajo reportamos los resultados de la construcción de una biblioteca de NanoAcs contra la región del tallo de la proteína HA del virus de influenza y de la proteína E del virus del Dengue (DENV). Dos llamas fueron inmunizadas con cinco inmunizaciones de 50 g de proteína HA recombinante de influenza, de los subtipos H5N1 y H3N8, y 100 g de virus del Dengue purificado e inactivado de los serotipos DENV-1 (cepa HW); DENV-2 (cepa NGC), DENV-3 (cepa Philippines/H87/1956) y DENV-4 (aislamiento 8124). La respuesta de anticuerpos de los isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 se determinó luego de cada inmunización utilizando anticuerpos específicos mediante la técnica de ELISA. Una vez alcanzada una buena respuesta inmune, los animales fueron sangrados y se extrajo ARN de los linfocitos aislados. Se preparó ADNc y se realizaron dos PCR para clonar los genes de inmunoglobulinas, la última con oligonucleótidos que permitieron ligar los fragmentos obtenidos en el vector fagémido pHEN4. Bacterias TG1 fueron transformadas con la ligación y se obtuvo una biblioteca representativa del repertorio de genes de cada llama. Los resultados de los ELISAs indicaron que ambas llamas fueron efectivamente inmunizadas. La respuesta inmune fue elevada contra los cuatro serotipos de DENV. La respuesta contra HA de influenza fue menor, por lo que fueron necesarias nuevas inmunizaciones. Las PCRs realizadas para clonar el repertorio de genes permitieron obtener inicialmente bandas correspondientes a las regiones variables de los anticuerpos convencionales y no convencionales. La segunda PCR permitió aislar únicamente los fragmentos provenientes de los anticuerpos no convencionales, que son los que dan lugar a los NanoAcs. Posteriormente, se prepararon bacterias TG1 competentes de alta eficiencia que permitieron generar una biblioteca de genes de inmunoglobulinas. Bacterias conteniendo los vectores fagémidos serán infectadas con un fago helper para producir fagos que expresen los NanoAcs. Mediante un procedimiento de biopanning se espera seleccionar NanoAcs que tengan propiedades de unión específica contra las proteínas inoculadas.