Study of PhaP from Azotobacter FA-8 sp. cellular localization in recombinant Escherichia coli

MEZZINA, M. P; DINJANSKI, N,; PETTINARI, M. J; PRIETO, M, A

Bioplásticos

Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED)

Lugar: Madrid; Año: 2014; p. 1 - 4

Las fasinas son proteínas que se asocian a gránulos intracelulares de polihidroxialcanoato (PHA). Además de losgenes que catalizan la biosíntesis de polímero, los productores de PHA naturales tienen varios genes implicados enla formación de gránulos y/o con funciones regulatorias. Entre estos genes se encuentran las phasinas, que se hademostrado que afectan la síntesis de polímero y el número y tamaño de los gránulos de PHA. El estudio de phasinasde diferentes productores de PHA ha revelado que estas proteínas presentan distintas propiedades, que permitieronel desarrollo de varias aplicaciones biotecnológicas. En nuestro trabajo, utilizamos PhaP de Azotobacter spFA- 8, un microorganismo que produce poli (3-hidroxibutirato ) ( PHB ), el PHA más conocido. phaP ha sido clonadoy expresado en E. coli. Se observó que las cepas de E. coli productoras de PHB que sobreexpresan PhaP crecenmás y acumulan más polímero. Éstos resultados sugieren que, al igual que lo observado en otras bacterias productorasde PHB, PhaP ejerce un efecto promotor del crecimiento en los recombinantes productores de PHB. En nuestrolaboratorio, el efecto de PhaP se analizó también en cepas no productoras de PHB, observándose que la expresiónde esta proteína heteróloga tiene un efecto protector inesperado en E. coli, tanto en condiciones normales como de estrés, lo que resulta en un mayor crecimiento y mayor resistencia a choque térmico y a estrés oxidativo porparaquat. Para caracterizar en mayor profundidad el efecto protector de PhaP en E. coli recombinante, se analizó lalocalización celular de la proteína en diferentes condiciones.La localización subcelular de PhaP se analizó por microscopía de fluorescencia utilizando una proteína de fusiónPhaP?GFP. En cepas de E. coli no productoras de PHB, PhaP se encontró soluble en el citoplasma durante las primerashoras de cultivo y luego emigró a los polos de las células y al septo formado entre dos células en división.Por otro lado, cuando PhaP se produjo en células productoras de PHB, se observó que la proteína colocalizaba conlos gránulos intracelulares de PHB, que fueron teñidos con Rojo Nilo para poder visualizarlos. Parte de la proteínatambién se encontró soluble en el citoplasma.Se purificaron gránulos de PHB usando un gradiente de glicerol y se realizó un SDS ?PAGE para observar lasproteínas resentes en dicha fracción. Se encontró una banda correspondiente a PhaP - GFP en la fracción de PHB, loque indica que la proteína de fusión estaba presente en los gránulos y que conservaba la función phasina.Por último, se llevaron a cabo experimentos de TEM con el fin de analizar con más detalle la localización intracelularde PhaP en cepas de E. coli productoras de PHB. Cuando PhaP fue coproducida con el polímero, se observóque se modificó la morfología de las células, sido más alargadas que las células de la cepa control que no producíael polímero, y con una distribución irregular de gránulos. En muchas células los gránulos de PHB se encuentraronen los polos de la célula.