Análisis de la Actividad Catalítica de Cruzipaína mediante Estudios de Dinámica Molecular Híbrida QM/MM

QUEVEDO, MARIO ALFREDO; CERUTTI, JUAN PABLO; ROITBERG, ADRIAN

Guatemala

Simposio; Simposio Iberoamericano COIFFA 2020; 2020

Conferencia Iberoamericana de Facultades de Farmacia

Cruzipaína (CZP) es la principal cisteín proteasa de T. cruzi, el agentecausal de la Enfermedad de Chagas. Su sitio activo se caracteriza por la presencia de 3subdominios principales (S1-S3) y de una triada catalítica formada por Cys25, His162 yAsn182 (Fig. 1). Ante el interés por el desarrollo de inhibidores de CZP y especialmenteen el contexto del diseño racional de potenciales fármacos, resulta esencial esclarecerdetalladamente los mecanismos moleculares implicados en su actividad catalítica ypotencial de inhibición. Una de las metodologías más empleadas a tal fin es la que aplicaestudios de dinámica molecular híbrida clásica-cuántica, conocidos como QM/MM-MD(Quantum Mechanics/Molecular Mechanics Molecular Dynamics). Este estudio permiteevaluar la coordenada de reacción catalítica de la enzima segmentando el sistema deinterés en múltiples regiones, modelando cada una de ellas empleando un nivel decálculo adecuado para describir las propiedades estructurales, electrónicas yenergéticas de todo el sistema con un costo computacional moderado. Este método hasido utilizado con éxito en la descripción detallada de diversas reacciones de relevanciaen el campo de la bioorgánica. Recientemente, Moliner y colaboradores han reportadolos resultados de estudios QM/MM-MD del mecanismo catalítico de CZP frente a unsustrato no específico. Sin embargo, la actividad catalítica de CZP frente a sustratosespecíficos, tales como el dipéptido fluorogénico comercial Z-Phe-Arg-AMC (Z-FR-AMC,Fig. 1A) que es ampliamente empleado en ensayos biológicos, no ha sido reportadahasta el momento. Asimismo, los estudios de QM/MM-MD han sido empleados parapredecir los mecanismos de inhibición de algunos inhibidores irreversibles de CZPreportados, tales como halometilcetonas, dipeptidil nitroalquenos y la vinilsulfonaK777 (Fig. 1B). Este último constituye uno de los inhibidores de CZP más estudiados yque ha demostrado prometedora actividad antichagásica en estudios preclínicos. Porotra parte, a pesar de que se han reportado estructuras cristalográficas homodiméricasde CZP (CZP-HD) y que se conoce que algunas cisteín proteasas relacionadas a CZPfuncionan catalíticamente como dímeros (ej.: Mpro de SARS-CoV-2), todos los estudiosin silico reportados al momento han sido realizados frente a la estructura monoméricade CZP (CPZ-MO), originando una descripción incompleta de las relaciones estructuraactividad relacionadas con la ocupación del subsitio S1 de la enzima. Finalmente, la relevancia de la estereoquímica para los procesos catalíticos e inhibitorios de CZP hasido reportada desde el punto de vista experimental, aunque no exhaustivamenteexplorada a nivel molecular empleando metodologías computacionales. OBJETIVO:Modelar y comparar las coordenadas de reacción de CPZ-MO y CZP-HD, evaluando unsustrato comercial (Z-FR-AMC) y un inhibidor irreversible (K777) con diferenteestereoquímica, a través de estudios QM/MM-MD Las estructuras de CZP-MO y CZP-HD fueron extraídas de Protein Data Bank (PDB ID: 4IUT y 4PI3). Z-FR-AMC y K777 con configuraciones (S,S) y (S,R) fueron sometidos a estudios de docking molecular empleando el software DOCK6 y loscomplejos resultantes fueron estudiados mediante dinámica molecular clásica (MMMD) en condiciones de solvente explícito, empleando el paquete Amber20h. Luego derealizar estimaciones de la energía libre de unión (dGMM-GBSA), las coordenadas finalesde las simulaciones MM-MD se seleccionaron como punto de partida para los estudiosde QM/MM-MD, analizando la coordenada de reacción catalítica de CZP aplicando lametodología de umbrella sampling. Todos los cálculos se llevaron a cabo empleando elpaquete Amber20, aplicando el método semiempírico SCC-DFTB en la capa cuántica delsistema (ligando y triada catalítica) y los campos de fuerza ff14SB y TIP3P para describirla región clásica (región estructural de la proteína y solvente). Los perfiles de energíalibre de reacción se obtuvieron aplicando el método de análisis de histogramaponderado implementado en vFEP (Variational free energy profile). Las simulacionesQM/MM-MD se llevaron a cabo en los sistemas de cómputo Hipergator (UFL-USA) yTupac (Argentina). RESULTADOS: La unión y la coordenada de reaccióncorrespondientes al sustrato (S,S)-Z-FR-AMC fueron evaluadas para CZP-MO y CZP-HD. Seobservó una mayor afinidad por CZP-HD que por CZP-MO, con dGMM-GBSA de -59±3 y -37±2kcal/mol, respectivamente. La interacción favorable entre el grupo guanidino (R1) delsustrato y los residuos Ser64 y Asp376 de CZP-HD es la responsable de la estabilizaciónadicional observada. Respecto a la reacción de acilación de CZP sobre el sustrato, sepudo observar que la energía de activación del intermediario tetraédrico (tiohemiacetal)es 6 kcal/mol mayor para CZP-MO (Ea=18.5 kcal/mol) comparado con CZP-HD (Ea=12.5kcal/mol). Respecto de la estereoselectividad de CZP, cuando se evaluó eldiastereómero (S,R)-Z-FR-AMC, se observaron valores de GMM-GBSA similares a los de(S,S)-Z-FR-AMC (-52±3 y -34±2 kcal/mol, para CZP-HD y CZP-MO, respectivamente). Sinembargo, se observó que las energías de activación para la reacción de acilación de (S,R)-Z-FR-AMC son significativamente mayores que las calculadas para el diastereómero(S,S)-Z-FR-AMC (35.2 kcal/mol y 28.4 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente) Ello es consistente con la estereoselectividad de CZP observada experimentalmente.Respecto del inhibidor irreversible K777, se observó un comportamiento homólogo aldel sustrato Z-FR-AMC. En tal sentido, las GMM-GBSA calculadas para la configuración(S,S) fueron de -31±3 y -46±4 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente;observando nuevamente que la orientación del sustituyente R1 hacia el par Ser64-Asp376 de CZP-HD aporta la estabilización adicional. Al comparar las energías deactivación asociadas a la coordenada de reacción para la inhibición, se observó que lareacción es 4.4 kcal/mol más favorable para CZP-HD (Ea=12.0 kcal/mol) que para CZP-MO(Ea=16.4 kcal/mol). En los estudios de estereoselectividad empleando (S,R)-K777, sehallaron resultados homólogos a los descritos para Z-FR-AMC. En este sentido, los dGMMGBSA de (S,R)-K777 son comparables a los de (S,S)-K777 para ambos sistemas (-28±3kcal/mol y -43±3 kcal/mol para CZP-MO y CZP-HD, respectivamente), con energías deactivación para las reacciones de acilación siendo 9.2 y 9.4 kcal/mol más altas que para(S,S)-K777 (25.6 kcal/mol para CZP-MO y 21.4 kcal/mol para CZP-HD). Las energías deactivación menos favorables para el sustrato e inhibidor con configuración (S,R) puedenexplicarse en términos de factores estéricos, ya que para que las reacciones tenganlugar, los ligandos deben acercarse al residuo catalítico de CZP (Cys25). Por ende, laconfiguración del Cα al centro electrofílico debe ser la adecuada para que el sustituyenteR1 pueda orientarse correctamente evitando el bumping con el backbone de la enzima.Los mecanismos catalíticos y de inhibición de CZP fueron evaluadosmediante estudios de docking molecular, MM-MD y QM/MM-MD. Para los 4 ligandosestudiados, se observaron valores de las dGMM-GBSA más negativos y energías deactivación menores para las reacciones catalizadas por CZP-HD, lo que sugiere lapotencial actividad homodimérica de CZP. Esta hipótesis es consistente con la potenteactividad inhibitoria de Chagasina, inhibidor natural de CZP que bloquea lahomodimerización de la enzima. Asimismo, se pudo justificar a nivel molecular laestereoselectividad catalítica de CZP, la cual se encuentra principalmente relacionada arequerimientos estéricos asociados a la coordenada de reacción. Finalmente, elprotocolo desarrollado demostró excelente potencial para el diseño racional de nuevosy potentes inhibidores irreversibles de CZP.