Desarrollo de un método bioanalítico para estudios de permeación intestinal de hidroclorotiazida

ONNAINTY RENÉE; QUEVEDO M. ALFREDO; LONGHI, MARCELA R,; SCHENFELD ESTEBAN M; GRANERO, GLADYS E.

Jornada; VII Jornadas de posgrado y I Jornada de ciencia y tecnología; 2016

El objetivo de este trabajo fue el desarrollo y la validación de una metodología bioanalítica para la cuantificación de hidroclorotiazida (HCT) por HPLC-UV, en medio de cultivo TC199, utilizado en los estudios de permeación intestinal realizados aplicando la técnica ex vivo de saco intestinal evertido en ratas. La HCT es un diurético ampliamente utilizado para el tratamiento de la hipertensión. La preparación de las muestras analíticas para el HPLC requirió de la extracción en fase sólida de la HCT, utilizando cartuchos de sílica y una solución de H2O:MeOH 90:10 como solvente de elusión y lavado. La HCT se eluyó del cartucho con ACN, posteriormente se evaporó a sequedad y se resuspendió en MeOH (400 µl) para su cuantificación por HPLC. El análisis cromatográfico se realizó utilizando una columna Restek C18 de 15 cm x 4,5 mm x 5 μm, con precolumna C18 Phenomenex, con fase móvil de H2O acidificada con ácido acético (pH 3,6): MeOH 80:20, a un flujo de 1 mL/min. El volumen de inyección fue de 15 µL y la columna se mantuvo termostatizada a 35 °C. Se utilizó un detector UV-Vis a una longitud de onda de 270 nm. Como estándar interno se eligió cafeína.La metodología bioanalítica propuesta se validó en relación a la selectividad, límite de detección, recuperación, exactitud y precisión. El método propuesto fue selectivo y lineal en el rango de concentraciones estudiados, con un LOD de 1.7x10-8M y un LOQ de 1.86x10-6 M, con una recuperación mayor al 98%, una exactitud de 98 ? 110% y una precisión inter e intra día con un R.S.D < 4%.En el contexto del desarrollo bioanalítico proyectado a estudios de permeabilidad intestinal, también se evaluó la viabilidad ex vivo del tejido intestinal en las condiciones de ensayo. Para ello, se determinó la capacidad concentración de glucosa de los segmentos intestinales aislados en medio de cultivo TC199. Estos resultados evidenciaron que la relación de concentración de glucosa entre solución serosal/solución mucosal fue mayor a la unidad durante los 120 min de ensayo, confirmando la capacidad de concentración de la misma y la consiguiente viabilidad del tejido.El método validado fue aplicado a la determinación de la permeabilidad intestinal de HCT. Dichos estudios se llevaron a cabo empleando soluciones de 0,18 mg/ml de HCT, cuantificándose un flujo de 0,0647 µg/min y la permeabilidad aparente (Papp), 0,145x10-4 cm/min del PA.