Desarrollo de un método bioanalítico de permeación intestinal de hidroclorotiazida

ONNAINTY RENEE; SCHENFELD ESTEBAN; QUEVEDO MARIO ALFREDO; LONGHI MARCELA; GRANERO GLADYS

Congreso; VI Congreso Iberoamericano de Ciencias Farmacéuticas; 2015

El objetivo de este trabajo fue el desarrollo y validación de una metodología bioanalítica para la cuantificación de hidroclorotiazida (HCT) por HPLC-UV, en medio de cultivo TC199, aplicable a estudios de permeación intestinal empleando la técnica ex vivo de saco intestinal evertido en ratas. La HCT es un diurético ampliamente utilizado para el tratamiento de la hipertensión. Este principio activo (PA) pertenece a la clase IV del Sistema de Clasificación Biofarmacéutico, debido a su baja solubilidad en agua y baja permeabilidad intestinal.Los procedimientos analíticos de cuantificación de HCT por HPLC requirieron de una etapa de preparación de las muestras mediante extracción en fase sólida (SPE), utilizando cartuchos Sep Pak Plus® 60 mg (Phenomenex®). Se empleó una mezcla H2O:MeOH (90:10) como solvente de elusión y lavado, eluyendo la HCT con acetonitrilo (ACN). La muestra fue posteriormente evaporada a sequedad y resuspendida en MeOH (400 μl) en el momento de su cuantificación por HPLC.El análisis cromatográfico se realizó utilizando una columna Restek C18 de 15 cm x 4,5 mm x 5 μm, con precolumna C18 Phenomenex, con una fase móvil de H2O acidificada con ácido acético (pH 3,6): MeOH 80:20, a un flujo de 1 ml/min. El volumen de inyección fue de 15 μl y la columna se mantuvo termostatizada a 35 °C. Se utilizó un detector UV-Vis a una longitud de onda de 270 nm. Como estándar interno se eligió cafeína.La metodología bioanalítica propuesta se validó en relación a su selectividad, límite de detección, recuperación, exactitud y precisión. El método propuesto fue selectivo y lineal en un rango de concentraciones de 1.86x10-6M ? 8.9x10-5 M (r2= 0.99), con un LOD de 1.7x10-8M y un LOQ de 1.86x10-6 M. La recuperación del analito fue mayor al 98%, con una exactitud de 98 ? 110% y una precisión inter e intra día con un R.S.D < 4%.En el contexto del desarrollo bioanalítico proyectado a estudios de permeabilidad intestinal, también se evaluó la viabilidad ex vivo del tejido intestinal en las condiciones de ensayo. Para ello, se determinó la capacidad de concentración de glucosa en medio de cultivo TC199 de los segmentos intestinales aislados. Estos resultados evidenciaron que la relación de concentración de glucosa entre solución serosal/solución mucosal fue mayor a la unidad durante los 120 min de ensayo, confirmando la capacidad de concentración del tejido y la consiguiente viabilidad del mismo.El método validado fue exitosamente aplicado a la determinación de la permeabilidad intestinal de HCT. Dichos estudios se llevaron a cabo empleando soluciones mucosales conteniendo 0.18 mg/ml de HCT, calculándose para el PA un flujo de 0.0647 μg/min y una permeabilidad aparente (Papp) de 0.145x10-4 cm/min.En base a los resultados obtenidos, se puede concluir que se logró desarrollar y validar satisfactoriamente una metodología bioanalítica para la cuantificación de HCT en estudios de permeabilidad ex vivo en ratas.