Clonado, Expresión y Purificación de Proteínas Recombinantes

GRASSO EJ; MIHELJ P; SOTTILE AE; CORONEL CE

Córdoba

Jornada; IV Jornadas de difusión de investigación y Extensión en Ingeniería Química FCEFyN-UNC ?Difundir para crecer?; II Jornadas ICTA ?Vincular Para Crecer?; 2016

Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, UNC; Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

El interés de nuestro laboratorio es la caracterización estructural y funcional de proteínas del tracto reproductor de mamíferos a fin de definir su función en la fertilización. La purificación a partir de los órganos ó fluidos del tracto reproductor es relativamente sencilla, pero requiere de muchos días de trabajo y de un número importante de animales para obtener cantidades significativas de la proteína. Por ello, hemos explorado la expresión de estas proteínas en sistemas heterólogos (bacterias) usando la técnica de ADN-recombinante. Como modelo experimental se usó la proteína caltrin (calcium transport inhibitor) de la secreción de vesícula seminal, la que se une a los espermatozoides durante la eyaculación y modula la fisiología espermática. Esta proteína también inhibe la actividad de proteasas para preservar a las gametas durante la fertilización. Esta propiedad le da interés tecnológico por su posible utilización como preservante en la industria de alimentos. En este estudio, el ARN aislado de vesícula seminal fue purificado usando un protocolo estándar. El ADN copia fue generado por retro-transcripción y amplificado por PCR usando cebadores específicos, conteniendo secuencias para el clonado direccional con enzimas de restricción. El fragmento amplificado y digerido, fue insertado en un plásmido de expresión procariota diseñado para expresar la proteína de interés fusionada a un fragmento proteico con capacidad de autoproteólisis (inteina), lo que facilita su posterior purificación a través de cromatografía de intercambio iónico. La secuencia de bases del inserto y su correcta incorporación en el marco de lectura del plásmido fueron corroboradas por secuenciación enzimática. El plásmido fue transformado en bacterias E.coli ER2566 competentes mediante shock térmico. Los clones recombinantes fueron seleccionados por SDS-PAGE y Western Blot luego de la inducción de la expresión de caltrin-inteina con el análogo de lactosa IPTG. Con el fin de optimizar la expresión, se ensayaron distintas condiciones de cultivo e inducción. La proteína de fusión caltrin-inteina fue purificada por cromatografía líquida en una columna de qutina, un polisacárido cargado con gran afinidad por inteina. El clivaje de la unión caltrin-inteina se realizó usando agentes los reductores DTT ó cisteína. La proteína recombinante se usará para profundizar los estudios sobre su rol biológico en la fertilización y su posible uso como conservante de alimentos a nivel industrial.