Hidrólisis de lactosa catalizada por cuerpos de inclusión de lactasa recombinante

BIANCO, MARIA J.; FLORES, SANDRA S.; PERILLO, MARÍA A.; SANCHEZ, JULIETA M.

Cordoba

Congreso; V Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CICYTAC 2014); 2014

La obtención de beta-Galactosidasa (lactasa o beta-Gal) por técnicas de ingeniería genética mediante la sobreexpresión como proteína recombinante (heteróloga) en un microorganismo posee gran interés para aplicaciones nutricionales y tecnológicas. En estas condiciones, se forman agregados intracelulares de proteína, consistentes en estructuras esféricas insolubles , enriquecidos en la proteína heteróloga, conocidos como cuerpos de inclusión (IB). La formación de IB es el principal cuello de botella en la producción microbiana de proteínas recombinantes, representando un obstáculo en la producción industrial de enzimas solubles y de biofármacos. Sin embargo, se demostró que los IB constituidos por enzimas mantienen propiedades funcionales similares a las de las proteínas que los conforman. Además, el tamaño de los IB (entre 0.3 y 1 µm) permite aislarlos del resto de contenido celular por centrifugación, lo que proporciona ventajas frente a la obtención de proteínas solubles. El objetivo de este trabajo fue producir IB de -Gal recombinante (IBβ-Gal) y evaluar las características funcionales y la estabilidad estructural de la proteína constituyente. Primeramente se comprobó que la inducción de la expresión de β-Gal a 37ºC (en lugar de 20ºC) favorece la agregación de la proteína como ya se describió en la bibliografía. Los IBβ-Gal se aislaron por sucesivos ciclos de lavado con soluciones de Triton X-100 (50 mM) y centrifugación a 10000 rpm durante 10 min; el sedimento obtenido se trató con DNAsa (25 ug/ml) a 37ºC durante 15 min. y finalmente se realizó una centrifugación a 10000 rpm durante 10 min. Se evaluó el efecto de la temperatura (T) y del pH sobre actividad catalítica, frente a lactosa, exhibida por los IBβ-Gal presentes en el sedimento final. En primer lugar, se demostró que IBβ-Gal tienen la capacidad de hidrolizar lactosa. Por otro lado, los perfiles de actividad mostraron que la T óptima de actividad es 45ºC, igual que la de la proteína soluble sin embargo, los IBβ-Gal presentan una mayor sensibilidad frente a los cambios de T con respecto a su contraparte soluble. Por otra parte, IBβ-Gal conserva el 70% de la actividad máxima en un rango de pH entre 3 y 6 donde la enzima soluble es completamente inactiva; esta característica funcional cobra interés en la industria láctea, ya que estos agregados de fácil obtención podrían ser utilizados para hidrolizar la lactosa presente en sueros lácticos ácidos. Palabras Clave: cuerpos de inclusión, beta-galactosidasa recombinante Agradecimientos: SeCyT, CONICET y Foncyt por el apoyo financiero. MAP y JMS son miembros de la CIC de CONICET.