Caracterización de lactasa superactiva frente a la hidrólisis de lactosa, en presencia de vesículas de fosfolípidos

FLORES, SANDRA S.; BIANCO, MARIA J.; PERILLO, MARÍA A.; SANCHEZ, JULIETA M.

Córdoba

Congreso; V Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CICYTAC 2014); 2014

Ciudad de las Artes

La hidrólisis de lactosa es un tema de interés nutricional y medicinal debido al problema de la intolerancia a la lactosa que se presenta en la adultez en la mayoría de la población humana. La terapia sustitutiva con la enzima lactasa (beta-Galactosidasa, beta-Gal) exógena puede ser una solución a este problema pero requiere de la vehiculización de la enzima en condiciones que preserven su actividad. En este sentido, nuestro laboratorio investiga formulaciones que permitan la administración de beta-Gal encapsulada en liposomas, usando alimentos como vehículo. Para esto es importante el estudio de la interacción de beta-Gal con interfases lipido-agua, y su efecto sobre la relación estructura/actividad de beta-Gal. Se demostró que la presencia de vesículas multilamelares de fosfolípidos (MLVs) activan a la beta-Gal nativa de E. coli (beta-Galwt) e inducen un cambio conformacional compatible con una mayor estabilidad frente al aumento de temperatura. En el presente trabajo se usó una beta-Gal recombinante que tiene adicionados residuos de histidina en el extremo carboxilo terminal (beta-GalHis), que fue sobreexpresada en E.coli y purificada por cromatografía de afinidad ión metal. Previamente habíamos demostrado que beta-GalHis era activada por la presencia de MLVs y que este efecto era potenciado cuando las MLVs estaban cargadas negativamente. Este resultado nos motivó a evaluar el efecto de MLVs sobre la conformación de beta-GalHis. Para esto se estudió la estructura de beta-Galwt y de beta-GalHis mediante el análisis del espectro de fluorescencia intrínseca de los triptófanos de la proteína (IF) en ausencia o en presencia de vesículas multilamelares (MLVs) de fosfatidil colina de huevo (EPC, interfase zwitteriónica) pura o en una relación molar 80:20 con dioleoil fosfatidil glicerol (EPC80/DOPG20), interfase negativa). Nuestros resultados mostraron que, en solución acuosa, se observa un leve desplazamiento en la max del espectro IF de beta-GalHis hacia menores longitudes de onda con respecto al espectro IF de beta-Galwt, lo cual refleja una estructura más compacta de la primera respecto a la segunda y podría ser atribuido a la presencia de la cola de Histidinas en beta-GalHis que está ausente en beta-Galwt, Por otro lado, mientras que la presencia MLVs afecta levemente el espectro IF de beta-Galwt la presencia de MLVs cargadas negativamente, induce un notable aumento de la intensidad de fluorescencia en el espectro de beta-GalHis y un desplazamiento de lambda max del espectro hacia menores longitudes de onda con respecto a lo que ocurre con la enzima en solución acuosa. Este efecto refleja que la interacción de la enzima recombinante con MLVs de EPC80/DOPG20 induce un cambio conformacional que se traduce en una enzima estructuralmente más estable y catalíticamente más activa frente a la hidrólisis de lactosa. Palabras Clave: lactasa, conformación, superactivación interfacial Agradecimientos: SeCyT, CONICET y Foncyt por el apoyo financiero. MAP y JMS son miembros de la CIC de CONICET