ACTIVIDAD DE LACTASA RECOMBINANTE EN PRESENCIA DE INTERFASES LIPÍDICAS

FLORES, SANDRA S.; PERILLO,MA; SANCHEZ, JM

CORDOBA

Congreso; XIX JORNADAS CIENTIFICAS de la SOCIEDAD DE BIOLOGIA DE CORDOBA; 2013

Previamente demostramos que la actividad de la β-galactosidasa soluble tipo salvaje de E. coli (b-Galwt), frente a un sustrato soluble orto-nitrofenilgalactopiranósido (ONPG), aumenta en presencia de vesículas multilamelares (MLVs) formadas por fosfolípidos neutros. El objetivo del presente trabajo fue comparar la actividad de b-Galwt de E. coli (Sigma-Aldrich) con una b-Gal recombinante (b-Gal-His6), frente al sustrato natural (lactosa). b-Gal-His6 fue sobreexpresada en E.coli, y los 6 residuos de histidina (His-tag) fusionados en el extremo carboxilo terminal, facilitaron su purificación por cromatografía de afinidad ión metal (IMAC). La actividad enzimática se midió por espectrofotometría visible, en ausencia o en presencia de vesículas multilamelares (MLVs) de fosfatidil colina de huevo pura (EPC, interfase zwitteriónica) o en una relación molar 80:20 con dioleoil fosfatidil glicerol (EPC80/DOPG20), interfase negativa). Los parámetros cinéticos se determinaron ajustando el modelo michaeliano a los datos experimentales por medio de una regresión no lineal. Nuestros resultados mostraron que, respecto a b-Galwt, la b-Gal-His6 si bien exhibió una menor afinidad por el sustrato, mantuvo la superactividad interfasial (aunque también fue de menor magnitud que la de b-Galwt). Por otro lado, se observó que la presencia de MLVs de EPC:doPG indujo un aumento en KM (p<0.01) con respecto a la b-Gal-His6 libre. El aumento en  la actividad específica fue aún mayor (p<0.03) que el observado en presencia de interfases neutras, sugiriendo una mayor sensibilidad a las interacciones electrostáticas con la interfase lípido-agua negativamente cargada.