Evaluacion de la citotoxicidad de compuestos fenólicos con actividad gabaérgica.

DELGADO MARÍN LE; REINER G.N.; DE PAULA E.; GARCIA DA

Mar del Plata

Congreso; XXIX Congreso Argentino de Química; 2012

Asociación Química Argentina

IntroducciónEl receptor GABAA es el principal receptor inhibitorio del sistema nerviosocentral. Posee diferentes lugares de reconocimiento para la unión de ligandosespecíficos y moduladores. Estos compuestos son potencialmente útiles en medicinahumana como agentes analgésicos, anestésicos, ansiolíticos y anticonvulsivantes. Losmoduladores más conocidos son benzodiazepinas, barbitúricos y neuroesteroidesentre otros. Cada uno de estos compuestos se comporta como modulador alostéricode los demás potenciando, en general, su unión al receptor [1]. Recientemente,nuestro grupo de trabajo ha descripto a diferentes compuestos fenólicos derivados delpropofol, un reconocido agente gabaérgico, como modulares positivos de dichoreceptor [2,3,4,5]. En el presente trabajo, se evalúa la citotoxicidad de estoscompuestos, incluyendo a propofol como referencia, a concentraciones similares a lasque demostraron efectos farmacológicos.MetodologíaSe incluyeron en el presente trabajo cinco compuestos fenólicos: eugenol,timol, propofol y carvacrol y clorotimol. Propofol es un compuesto de síntesis,clorotimol es un monoterpenoide derivado de timol y los demás son componentesimportantes de numerosos aceites esenciales. Timol y carvacrol son extraídos deaceites esenciales de numerosas especies de tomillo (género Thymus) y de orégano(gen. Origanum) respectivamente, mientras eugenol se encuentra en numerosasespecies como la albahaca y el clavo de olor (gen. Ocimum y Syzygium) [6,7].Se realizaron cultivos primarios de neuronas corticales de embriones de rata(16-18 días de gestación) y se determinaron sus efectos sobre la viabilidad celular através de la evaluación de la integridad mitocondrial de la célula (reducción de MTT) yde la integridad de la membrana celular (liberación de Lactato Deshidrogenasa ?LDH).Los cultivos y ambas técnicas nombradas se realizaron según lo indicado en García etal., (2006) [3]. Brevemente, se disecan las cortezas cerebrales de embriones de ratasde 16-18 días de gestación y tras la digestión con tripsina, se centrifuga y aspira elsobrenadante para luego proceder a la digestión mecánica. Las células obtenidas seresuspenden en medio de cultivo apropiado. Los ensayos se realizan entre los 6-7días in vitro, cuando estas células expresan el receptor GABAA funcional.Para valorar la toxicidad de los compuestos se analizó paralelamente sucapacidad de inducir hemólisis en condiciones isotónicas, siguiendo la técnicadescripta por Malheiros et al. [8]. La sangre fue suministrada por el banco de sangredel Hemocentro de Campinas. Los eritrocitos fueron obtenidos y diluidos en PBS, pH7.4, hasta una absorbancia aproximada de 0,9 a 412 nm (hematocrito del 0,15%).Luego, se prepararon las muestras con los correspondientes compuestos fenólicos yse dejó incubar durante 15 minutos a 37°C. Finalmente, después de una centrifugacióna 1500 g por 10 min, se midió la concentración de hemoglobina liberada alsobrenadante para calcular el porcentaje de hemólisis (% H) como se describe acontinuación:% H = [(AS - APBS) / (AH2O - APBS)] * 100donde AS , APBS y AH2O corresponden a las absorbancias a 412 nm de la solución deeritrocitos en presencia del compuesto (muestra), resuspendidos en buffer (control) oresuspendidos en agua (100% hemólisis), respectivamente.ResultadosEl análisis de los resultados de los ensayos de citotoxicidad, realizados enneuronas corticales, mostró que ninguno de los compuestos ensayados disminuyósignificativamente la viabilidad celular a concentraciones donde los mismosdemostraron tener actividad sobre el receptor GABAA. Esto implica que la presencia delos compuestos fenólicos ensayados, al menos hasta 24 hs posteriores a suincorporación al medio de cultivo, no alterarían la integridad mitocondrial y de lamembrana plasmática de las neuronas a concentraciones farmacológicamente activas.Sin embargo, en caso del clorotimol, si bien no demostró un claro efecto sobre laviabilidad neuronal según los ensayos realizados, las células mostraron signosmorfológicos de daño a concentraciones mayores a 100 μM.Los resultados de hemólisis mostraron que ninguno de los productosensayados indujo la rotura de los eritrocitos como consecuencia de su actividad sobrela membrana de los mismos ya que los porcentajes de hemólisis no fueronsignificativamente diferentes a la muestra control (eritrocitos en ausencia de loscompuestos).ConclusionesLos datos obtenidos de los ensayos realizados sugieren la ausencia decitotoxicidad de los compuestos fenólicos estudiados al menos hasta 24 hs deexposición a los mismos y a concentraciones similares a las farmacológicamenteactivas sobre el receptor GABAA. A pesar de su alta lipofilicidad y tendencia aparticionarse en fases membranosas [9] ningún compuesto mostró capacidadhemolítica.Referencias1. Mac Donald and Olsen (1994). Biochem Pharmacol. 68,16752. Sánchez et al. (2004) Coll Surf B. 34, 773. García et al. (2006) Neuropharmacol. 50, 254. García et al. (2008) Eur J Pharm. 600, 265. Reiner et al. (2010) XXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigaciónen Neurociencias.6. Brand-Williams et al. (1995) Food Sci Technol. 28, 25.7. Ruch et al. (1989) Carcinogenesis. 10(6), 1003.8. Malheiros et al. (1998) Biochim Biophys Acta 1373, 332.9. Reiner et al. (2009) J Pharm Biomed Anal 49, 686.