Condiciones de producción y comportamiento térmico de lactasa recombinante

JM SANCHEZ; M.A. PERILLO

Congreso; IV Congreso internacional de Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de los Alimentos; 2012

Universidad Nacional de Cordoba. Ministerio de Ciencia y Tecnologia de la Provincia de Córdoba

En nuestro laboratorio estamos estudiando los perfiles térmicos de lactasas de distinto origen. Uno de los objetivos es la obtención de una enzima para el deslactosado de alimentos a escala piloto por lo que estamos interesados en seleccionar lactasas resistentes a altas temperaturas para favorecer la eficiencia del proceso. En este trabajo se evaluaron diferentes condiciones de cultivo para la producción de una lactasa recombinante (beta-Gal-His6). Previamente se transformaron bacterias E. coli BL21lpir-codon plus con el plásmido pET26 (+). pET26 (+) recombinante presenta el gen de beta-galactosidasa unido a una secuencia de nucleótidos que codifica para 6 residuos de histidina (His-tag) ubicados en el extremo carboxilo terminal de la proteína. Esta secuencia adicional facilita la purificación de la enzima por cromatografía de afinidad ión-metal (IMAC).Se evaluó el efecto de dos variables sobre la producción de lactasa activa en dos etapas sucesivas del cultivo bacteriano. En la primera etapa se evaluaron diferentes condiciones de densidad de bacterias medida como densidad óptica (DO) (0,45 y 1), en una etapa subsiguiente se estudiaron diferentes concentraciones de inductor de la expresión de lactasa (IPTG) (0,4 mM y 1 mM). El efecto de DO e IPTG se valoró sobre la base de la actividad de lactasa frente al sustrato lactosa con el método de la glucosa oxidasa por espectrofotometría visible. Nuestros resultados mostraron que si bien la mayor biomasa bacteriana induce el mayor nivel de proteína activa no es conveniente utilizar una concentración elevada de inductor debido a que no se obtiene un aumento proporcional en la cantidad de proteína activa. Esto podría ocurrir debido a que una exagerada expresión de la proteína podría resultar nociva/letal para la bacteria.Posteriormente, la relación estructura/actividad se estudió comparativamente en lactasa recombinante con respecto a lactasa nativa (beta-Galwt). Se analizó el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática y además la posible inactivación frente a la preincubación a temperaturas extremas. Por otro lado se realizaron experimentos de Calorimetria Diferencial de Barrido (DSC) para conocer las temperaturas de desnaturalización de las proteínas. Ambas enzimas presentaron un perfil similar de actividad específica (AE) frente a la temperatura e incluso alcanzan la máxima AE a la misma temperatura (Tmax=50ºC), aunque la actividad específica de la lactasa recombinante es marcadamente menor que la de lactasa nativa (AEbeta-GalHys = 11,6 mmol/min/mg vs AEbeta-Galwt =20.5 mmol/min/mg), en la primera se observó una leve resistencia frente a la inactivación por temperatura (ET50,beta-GalHys=46.3ºC; ET50,beta-Galwt=43). Este resultado podría ser explicado por una mayor estabilidad estructural (determinada por DSC)  (Tmbeta-GalHys=61.2ºC,  Tmbeta-Galwt=59.5ºC).