ESTUDO DA INTERAÇÃO DETERGENTE-MEMBRANA ERITROCITÁRIA E SUAS FRAÇOES RESISTENTES À SOLUBILIZAÇÃO, EM MONOCAMADAS DE LANGMUIR

CASADEI, B. R.; DOMIGUES, C. C.; CLOP, E. M.; PERILLO, M. A.; DE PAULA, E.

Sao Pedro

Congreso; AUTOORG 2012 – 3º Encontro sobre Estruturas Auto-organizadas em Soluções e Interfaces; 2012

Sociedade Brasileira de Bioquímica

Introdução A separação lateral de fases, que forma domínios (lipid rafts) ricos em esfingolipídios, colesterol e proteínas específicas, é um fenômeno das biomembranas que tem sido associado a diversos processos biológicos. Experimentalmente, DRMs (detergent-resistant membranes) consistem em um modelo extensivamente usado para o estudo de rafts1. Monocamadas lipídicas formadas na interface ar-água são bastante úteis para estudo das propriedades dos componentes de membranas. Este sistema permite manter uma topologia planar constante e o controle do empacotamento molecular. Neste trabalho, estudamos as propriedades das monocamadas formadas por lipídios de DRMs de eritrócitos humano preparadas com os detergentes não iônicos TX-100, Brij 98 e Brij 58 e investigamos o efeito da incorporação desses detergentes em monocamadas da membrana eritrocitária isolada (ghosts). Experimental Eritrócitos intactos ou com conteúdo reduzido de colesterol foram submetidos à ação dos detergentes (TX-100, Brij 98 ou Brij 58) e ultracentrifugados em um gradiente de sacarose descontínuo. As frações de DRMs obtidas foram submetidas à extração de lipídios pelo método de Folch2. Monocamadas na interface ar-água foram preparadas à temperatura ambiente a partir dos lipídios extraídos e caracterizadas em relação à pressão superficial (π) e epifluorescência com o marcador DilC18. Experimentos com tampão fosfato (5mM, 150 mM NaCl, pH 7,4) na fase aquosa também foram realizados. Experimentos sob diferentes pressões iniciais (π) foram feitos para avaliar a penetração dos detergentes em monocamadas de lipídios de ghosts. Valores de Delta pi (Delta π = πmax - πi) foram graficados contra πi e a intersecção da linha no eixo das abscissas permitiu calcular o valor máximo de pi para penetração do detergente (vcut-off). A cinética de incorporação dos detergentes nas monocamadas de lipídios de ghosts (πi ≈ 35mN/m) foi analisada pela mudança de pressão (deltaπ) em função do tempo, após injeção de diferentes concentrações de detergente. Resultados e Discussão As isotermas de compressão na interface ar-água, dos lipídios extraídos de ghosts e das DRMs apresentaram área de aproximadamente 40 Å2/molécula e pressão de colapso 48 mN/m, além de efeito de histerese após ciclo de compressão/descompressão. A isoterma de lipídios  extraídos de DRMs de TX-100 apresentou uma fase mais condensada, com reorganização em 14 mN/m. A coexistência de fases foi observada, principalmente, nas monocamadas de lipídios extraídos das DRMs. As monocamadas preparadas na presença de tampão fosfato se apresentaram mais expandidas e, nessas condições, a monocamada de DRMs de TX-100 não apresentou a reorganização descrita anteriormente. Já as monocamadas de  lipídios extraídos de DRMs preparadas com conteúdo reduzido de colesterol, apresentaram-se mais condensadas a 35 mN/m do que as demais correspondentes. Em experimentos de penetração, Brij 98 apresentou interação mais favorável com monocamadas de ghosts, seguido por Brij 58 e TX-100. Pela cinética de incorporação foi possível determinar a constante de ligação (Kb) detergentelipídios de ghosts onde Kb,Brij 98, Kb,Brij 58, Kb,TX-100. Conclusões Membranas resistentes a TX-100 são mais organizadas, apresentando cadeias acilas mais empacotadas que aquelas resistentes a Brij. Além disso, o potencial de penetração do detergente nas monocamadas de lipídios extraídos de ghosts, correlaciona-se com a razão detergente/lipídio para lise de eritrócitos (Resat)3 e não com a formação de uma fase lipídica mais ordenada (rafts). A organização dessas monocamadas é dependente da força iônica e do pH. Agradecimentos Programa Capes-Mincyt redes (# 001/2011) e FAPESP (# 09/904-1). REFERÊNCIA (1) Domingues, C., Ciana, A., Buttafava, A., Casadei, B., Balduini, C., de Paula, E., and Minetti, G. J Membr Biol. 2010, 234, 195-205. (2) Folch, J., Lees, M., and Sloane Stanley, G. H. J Biol Chem. 1957, 226, 497-509.(3) Casadei, B. R. Dissertação de Mestrado. 2011, Instituto de Biologia, Unicamp, Campinas - Brasil.