Estrategias de microscopía de correlación (CLEM) en criosecciones para la detección de receptores anti-mitogénicos en células tumorales

SOSA L.; PICECH F.; TORRES A. I.; LEIMGRUBER C.; PETITI J. P.

La Falda, Córdoba

Congreso; 5 Congreso Argentino de Microscopía SAMIC; 2018

SAMIC

En los últimos años, investigaciones en áreas biológicas relacionadas al estudio de expresión, localización y tráfico de proteínas han permitido comprender los mecanismos moleculares que regulan las principales respuestas biológicas. Para comprender mejor estos mecanismos, es necesario conocer detalladamente la dinámica intracelular de proteínas siendo la inmunofluorescencia y la inmunomarcación a nivel de microscopía electrónica (MET), las herramientas más apropiadas.Si bien la microscopía de luz ofrece un screening rápido de grandes áreas y la detección simultánea de múltiples antígenos, la MET permite la visualización de objetos, inmunomarcados o no, en alta resolución. Actualmente, se han desarrollado nuevas metodologías de miscroscopía de correlación (CLEM), que combina los beneficios de la microscopía de luz con la alta resolución y el detalle ultraestructural de la MET. Además de las técnicas convencionales de marcación a nivel ultraestructural, el desarrollo de metodologías de crio-inmuno MET han permitido obtener una mayor sensibilidad para detectar diferentes antígenos.El objetivo de este trabajo consiste en poner a punto diferentes metodologías de CLEM a partir de criosecciones (técnica de Tokuyasu) para detectar receptores de señales anti-mitogénicas en células tumorales adenohipofisarias.Se evaluaron dos estrategias: Corte fino (90 nm) montado en grillas de MET y cortes seriados donde una sección semifina (200 nm) es montada en un portaobjeto y el subsecuente corte fino en grillas para MET. En la primera estrategia, una única criosección se incubó con un anticuerpo primario y dos secundarios: fluorescente y acoplado a oro coloidal. La grilla fue visualizada por microscopia confocal (MC), luego desmontada y contrastada para su observación en MET. Para la segunda estrategia, en la criosección semifina se realizó la inmunofluorescencia para MC, mientras que la subsecuente criosección fina montada en una grilla fue inmunomarcada con anticuerpo secundario unido a oro coloidal, y visualizada por MET. En ambas estrategias las imágenes de las células de interés obtenidas por MC y MET fueron superpuestas para correlacionar la inmunofluorescencia con un contexto ultraestructural.La microscopía de correlación nos permitió observar la inmunofluorescencia de receptores de señales anti-mitogénicas SSTR5, TbRI o TbRII en un contexto ultraestructural en una misma célula. La elección de una estrategia dependerá del objetivo del investigador. Si el objetivo es la mayor inmunodetección de la molécula de interés, el uso de cortes seriados sería lo más adecuado debido a que los anticuerpos secundarios no compiten por un mismo primario. Además, la criosección fina permite una óptima visualización de la ultraestructura. Sin embargo, la obtención de cortes seriados resulta compleja ya que requiere destreza en el manejo del ultracriomicrótomo y la manipulación del material. Esta limitación puede sortearse utilizando criosecciones únicas montadas en grillas. En esta opción los anticuerpos secundarios (fluorescente y acoplado a oro) reconocen un mismo primario, por lo que la intensidad de señal es menor comparada con la opción anterior.Nuestros resultados indican que la estrategia más adecuada dependerá de la cantidad del antígeno de interés. Si es abundante, las criosecciones únicas serán suficientes para su visualización, mientras que para los antígenos de baja expresión la utilización de criosecciones seriadas facilitaría su observación.