TESTOSTERONA PROMUEVE PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS MUSCULARES LISAS PROSTÁTICAS VÍA RECEPTORES DE MEMBRANA PLASMÁTICA

LEIMGRUBER C; MALDONADO CA; PEINETTI N; AMADO A QUINTAR; SCALERANDI MV

Termas de Rio Hondo

Congreso; FASEN 2016; 2016

La próstata está formada por un compartimiento epitelial y la estroma fibromuscular. Las células musculares lisas prostáticas (CMLp) son las principales células estromales, están en estrechacomunicación con fibroblastos y con células epiteliales, cumpliendo un rol clave en el mantenimiento de la homeostasis glandular [1]. Testosterona regula estrictamente estas interacciones en condiciones normales, siendo el desbalance entre señales estimulatorias e inhibitorias la fisiopatogenia del crecimiento anómalo en la glándula como el cáncer y la Hiperplasia Prostática Benigna [2].Los efectos de testosterona son mediados por una vía canónica, la cual consiste en la difusión de la testosterona hacia el citosol donde se une al receptor clásico de andrógenos (AR), la consecuente migración del complejo hormona-receptor al núcleo celular y la unión a elementos de respuesta a andrógenos (ARE) donde regula la transcripción génica. En las últimas décadas se describieron vías no canónicas de señalización para las hormonas esteroideas en distintos tipos celulares, que incluyen la activación de receptores presentes en la superficie celular, desencadenando una serie de cascadas de señalización intracelular con diferentes acciones en las células [3]. En algunos casos, los efectos inducidos por vías no canónicas son diferentes a las canónicas, por lo que nuestro objetivo fue determinar la presencia de receptores para testosteronaen la membrana plasmática de CMLp y su participación en la proliferación celular in vitro.Para llevar a cabo este objetivo, se establecieron cultivos primarios de CMLp provenientes tanto de ratas Wistar normales como de pacientes con Hiperplasia Prostática Benigna (protocolos aprobados por el comité de ética del Sanatorio Allende, Córdoba). Las células fueron cultivadas en medio MCDB con 15% de SFB hasta que se obtuvo una confluencia del 80-90%. Luego, las células crecieron en un medio sin suero por próximas 72 hs., al cual se le agregó TGFβ (2ng/ml) parafavorecer el fenotipo muscular. Cumplido este periodo se realizaron los estímulos con testosterona (T) o testosterona acoplada a albumina sérica bovina (T-BSA), la cual le brinda un carácterhidrofílico y un aumento de tamaño que la hace impermeable a la membrana plasmática. Ambas moléculas se aplicaron a una concentración de 10-7M; como controles se utilizaron los vehículos respectivos para cada droga. Los resultados fueron analizados mediante ANOVA-Tukey.Considerando la bibliografía reportada en otras células, se evaluó en primera instancia la presencia del AR clásico en la membrana plasmática de CMLp de rata mediante inmunofluorescencia y microscopia confocal, observándose marca positiva en la superficie celular, que co-localizó con el marcador de membranas concanavalina-A. Este ensayo se corroboró mediante citometría de flujo, que arrojó un 18,87±2,43% de células positivas para el AR en la membrana celular. Asimismo, los resultados en CMLp humanas arrojaron datos similares. Para descartar falsos positivos, trabajamos con células vivas y realizamos además marcas para la proteína intracelular NF-kB (control negativo). Posteriormente, se verificó la capacidad de estos AR presentes en membrana (mAR) parareconocer a testosterona; para ello se incubaron las CMLp con T-BSA por 30 segundos y se realizó inmunofluorescencia usando un anticuerpo contra testosterona. Los resultados indican que T-BSA es reconocida por el mAR con el cual forma el complejo hormona-receptor. Con el fin de analizar la funcionalidad de los mAR y teniendo en cuenta que las vías no canónicas actúan a través de cascadas de señalización iniciadas en membrana, evaluamos las vías de MAPK yPI3K/Akt. Utilizando la técnica de western blot medimos la fosforilación de ERK y Akt luego de estímulos de 10, 20 y 30 minutos con T o T-BSA. Se observó un aumento en la fosforilación en todos los tiempos de estímulo, con un pico a los 30 minutos (p