ESPECTROMETRIA DE MASAS EN TANDEM: UNA PODEROSA HERRAMIENTA PARA LA CARACTERIZACIÓN DE ANTOCIANINAS EN ALIMENTOS.

LINGUA, M.; DI PAOLA, R.; WUNDERLIN D.A.; BARONI, M.V.

Los Cocos

Congreso; I° Congreso Argentino de Espectrometria de Masas.; 2012

SAEM

En los últimos años ha crecido el interés por el estudio de los pigmentos antociánicos debido a sus potenciales propiedades terapéuticas. Las antocianidinas son pigmentos naturales hidrosolubles presentes en los tejidos vegetales, responsables de la coloración rojo-azulada de tallos, hojas, flores, frutos y productos derivados. Estructuralmente son derivados polihidroxilados y polimetoxilados del catión flavilio, el cual posee un esqueleto C6-C3-C6, constituido por dos anillos fenilo (A y B) unidos a un anillo heterocíclico oxigenado (C). Todas las antocianidinas poseen el mismo esqueleto básico hidroxilado en posición 3, 5 y 7, y difieren en el número y posición de grupos -OH y –OCH3 en el anillo B (Figura 1). En soluciones ácidas, la carga positiva sobre el átomo de oxígeno provee una detección específica respecto de otras especies de flavonoides a 520nm. En la naturaleza, dichos compuestos se  encuentran principalmente glicosilados o acilglicosilados, denominados antocianinas (ANT). La glicosilación se observa mayoritariamente en las posiciones 3, 5 y 7; la esterificación con ácidos orgánicos en el azúcar de la posición 3 es la más frecuente. La amplia gama de variantes funcionales y los diferentes sitios de sustitución conducen a una multitud de compuestos estructuralmente similares, que dificultan su caracterización en mezclas complejas. La espectrometría de masas (MS) acoplada a la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), constituyen una de las herramientas analíticas más poderosa para la separación, detección e identificación de mezclas complejas de ANT. Dicha herramienta combina la habilidad del HPLC para separar especies estructuralmente similares, con la capacidad del MS para dilucidar la estructura de una molécula a partir del patrón de fragmentación generado.             El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método de HPLC-DAD-ESI-MS/MS que permita la separación y caracterización de ANT presentes en matrices alimenticias. El desarrollo del método se llevó a cabo sobre un extracto metanólico de uvas tintas. Se utilizó un equipo HPLC (Agilent Technologies) acoplado a un detector con arreglo de diodos (DAD) y a un espectrómetro de masas (MS). La separación se realizó sobre una columna de fase reversa (C18) (5 um, 250mm, 4.60 mm i.d.), termostatizada a 35 °C y aplicando un gradiente de solventes (A: ácido fórmico 0,5% v/v; B: ácido fórmico 0,5% v/v en metanol) a un flujo de 0,4 ml/min, durante 41 min. El MS consta de un cuadrupolo, seguido por un analizador de tiempo de vuelo (microTof-Q II, Bruker). Se utilizó una interfase de ionización por electrospray (ESI), operando en modo positivo. El estándar de Mv-3-glc se utilizó para establecer las condiciones óptimas del método de análisis. Los espectros MS2 fueron obtenidos por CID en modo automático. Los criterios de identificación utilizados fueron el orden de elución, los espectros de absorción UV-Vis y de MS y MS/MS. El método desarrollado permitió la identificación de 18 ANT (Tabla 1). En primer lugar, eluyeron los compuestos glicosilados, derivados de las 5 antocianidinas más abundantes en frutas y vegetales. El espectro de MS2 mostró el ión [M-162]+, correspondiente a la aglicona del [M]+ luego de la pérdida de la fracción hexosa. Además, la formación de iones derivados de la apertura del anillo y pérdida de moléculas neutras pequeñas (H2O, CO, C2H2O) colaboró en la identificación de los compuestos 1, 4 y 5. Luego de los compuestos glicosilados, eluyeron los compuestos acetil, cafeoil y cumaroil-glicosilados. El MS2 de los acetil-hexósidos correspondientes a las 5 antocianidinas encontradas mostró el fragmento [M-204]+, indicando la pérdida conjunta del azúcar y el ácido. Solo un cafeoil-hexósido fue identificado en la muestra por la presencia del fragmento [M-324]+ correspondiente a la aglicona. Se identificaron 4 cumaroil-hexósidos por la presencia del fragmento [M-308]+ (aglicona) en el MS2. El análisis de los espectros UV-Vis permitió confirmar la acilación de los antocianos, ya que se observó un máximo de absorción adicional en el intervalo 310-335 nm. Por otra parte, se identificaron 3 compuestos derivados de una ciclo-adición en posiciones 4 y 5. El CumaroilVitisin B, derivado de la adición de acetaldehído al Mv-cumhex, identificado por la presencia del fragmento [M-308]+. El Pigmento A (adición del 4-vinilfenol al Mv-hex) se identificó por la presencia del fragmento [M-162]+; y el Acetil-Pigmento A (adición del 4-vinilfenol al Mv-acetilhex) identificado por la presencia en el MS2 del fragmento [M-204]+.             El estudio demuestra que el mecanismo de fragmentación dominante en MS2 para ANT es la pérdida del resto glicosídico o acilglicosídico, debido a que este tipo de unión es mas lábil. Nuestros resultados indican que el uso de MS2 y espectros UV-Vis como sistema de detección, constituyen una herramienta poderosa en la identificación y caracterización de matrices ricas en ANT.